呂瑩，郝堯坤，張照蘭

河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

肝纖維化是由慢性肝損傷引起的病理狀態(tài)。慢性肝炎、膽汁淤積、酒精或藥物刺激均可引起肝損傷，并進一步激活肝損傷修復過程，引起肝纖維化，進而可發(fā)展為肝硬化，最終誘發(fā)肝癌發(fā)生［1－2］。軟肝丸是鱉甲、龜板、穿山甲、當歸、生牡蠣、桃仁、雞內(nèi)金、甘草等組成的復方制劑。研究表明，軟肝丸可有效地促進肝纖維化逆轉(zhuǎn)、改善門脈高壓進而延緩肝硬化發(fā)展［3］。肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）是肝纖維化進展的關鍵因素，肝損傷可誘導HSCs增殖、活化并分泌大量細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）［4］。轉(zhuǎn)化生長因子－β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）是活化的HSCs分泌的成纖維細胞因子，其可誘導HSCs分化為成肌纖維細胞促進肝纖維化形成［5］。研究發(fā)現(xiàn)，軟肝顆粒對肝纖維化大鼠TGF－β1／Smads通路具有調(diào)控作用［6］，但作用的分子機制尚不清楚。因此，本研究通過體外細胞實驗探討軟肝丸含藥血清對TGF－β1誘導人HSCs LX－2增殖、凋亡、纖維化及Smad通路相關蛋白表達的影響，進一步揭示其抗肝纖維化的潛在分子機制。

1 材料

1.1 動物與細胞SD雄性大鼠，體質(zhì)量（260±20）g，購于上海凱學生物科技有限公司，合格證號：SYXK（滬）2015－0016。人HSCs系LX－2購于武漢普諾賽生命科技公司。

1.2 藥物與試劑軟肝丸由鱉甲、龜板、穿山甲、當歸、生牡蠣、桃仁、雞內(nèi)金、甘草等組成，批號：豫藥制字Z20120712（鄭），專利號：ZL201310443782.1）。TGF－β1（美國Sigma公司，貨號：GF346）；細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit 8，CCK－8）、膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）－異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）／碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染法凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶生化公司，貨號分別為：CA1210、CA1020－20）；TUNEL試劑盒（美國Roche公司，貨號：11684817910）；總RNA快速提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaqTM（大連Takara公司，貨號分別為：9108／9109、RR047A、DRR820A）；兔源Ⅰ型膠原（collagenⅠ，Col－Ⅰ）、兔源Col－Ⅲ、兔源結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、兔源纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、兔源α平滑肌肌動蛋白（α－smooth muscle actin，α－SMA）、兔源β－肌動蛋白（β－actin）、羊抗兔IgG二抗抗體（上海艾博抗生物公司，貨號分別為：ab34710、ab7778、ab227180、ab2413、ab5694、ab8227、ab205718）。

1.3 儀器ELx80型酶標儀（美國BioTek公司）；ckx53ipc型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

2 方法

2.1 軟肝丸含藥血清制備將20只大鼠隨機分為4組，即對照組及低、中、高濃度軟肝丸（4.25 g·kg－1、8.5 g·kg－1、17 g·kg－1）組大鼠給予相應藥物，對照組給予同體積生理鹽水，連續(xù)給藥3 d，末次灌胃1 h后，腹主動脈取血。1 500 r·min－1離心15 min，將同組血清混勻，56℃水浴30 min，孔徑為0.22μm過濾器過濾除菌，分裝后－20℃保存?zhèn)溆茫?］。

2.2 細胞分組和細胞培養(yǎng)LX－2細胞采用高糖杜爾伯格伊戈爾培養(yǎng)基（dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）在37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中補充10%的胎牛血清。當細胞基本融合為一層時進行消化和傳代，選擇對數(shù)生長期細胞進行實驗?？瞻捉M：用80%DMEM培養(yǎng)基＋20%對照血清；TGF－β1組：用含10μg·L－1TGF－β1［8］＋80%DMEM培養(yǎng)基＋20%對照血清；低濃度含藥血清組：用10μg·L－1TGF－β1＋80%DMEM培養(yǎng)基＋20%低濃度軟肝丸含藥血清（0.17μg·L－1）；中濃度含藥血清組：用10μg·L－1TGF－β1＋80%DMEM培養(yǎng)基＋20%中濃度軟肝丸含藥血清（0.34μg·L－1）；高濃度含藥血清組：用10μg·L－1TGF－β1＋80%DMEM培養(yǎng)基＋20%高濃度軟肝丸含藥血清（0.68μg·L－1），每孔重復3次。共培養(yǎng)24 h。

2.3 CCK－8法檢測細胞活力每組取3×103個細胞加入96孔板，孵育24、48、72 h后，每孔加入10μL的CCK－8試劑，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，每孔重復3次，用酶標儀檢測各孔450 nm處光密度（optical density，OD）值。

2.4 流式細胞術和TUNEL法檢測細胞凋亡根據(jù)2.2培養(yǎng)細胞，分別用流式細胞術和TUNEL法檢測細胞凋亡。TUNEL法：將培養(yǎng)的細胞制片，40 ng·L－1多聚甲醛和體積分數(shù)80%乙醇固定后用磷酸鹽緩沖液洗片3次。吸水紙吸干玻片上水分，滴加反應液37℃孵育1 h。終止反應后進行TUNEL反應混合液標記，再次洗滌后進行酶標反應和染色，熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況。凋亡細胞顯示出黃綠色熒光，藍色熒光為核染色。

凋亡指數(shù)（%）＝凋亡細胞個數(shù)／總細胞個數(shù)×100%

流式細胞術法：將各組細胞制備5×104mL－1的細胞懸液，取100μL細胞懸液加入流式管，按照Annexin V－FITC／PI試劑盒分別加入5μL的Annexin V－FITC和PI。避光反應10 min后補加400μL的結合緩沖液上機檢測細胞凋亡情況。

2.5 RT－qPCR法檢測Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、CTGF、FN以及α－SMA mRNA表達將2.2培養(yǎng)的細胞，用總RNA快速提取試劑盒提取各組細胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），采用SYBR?PremixExTaqTMII進行RT－qPCR。反應體系為包含2×SYBR Premix ExTaqTM10μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，50×ROX ReferenceDye 4μL，cDNA模板2μL，補加滅菌蒸餾水至總體為20μL。反應條件95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火／延伸35 s，共40個循環(huán)。2－ΔΔCt法分析mRNA表達量。引物序列（5′－3′）如下：內(nèi)參β－actin上游GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA，下游GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG；Col－Ⅰ上游TCAGGGGCGAAGGCAACAGT，下游TTGGGATGGAGGGAGTTTACACGA；Col－Ⅲ上游CGTCCTGCAGGTAACAGTGGTTC，下游TGCTCCAGTTAGCCCTGCAA；α－SMA上游CTAAGGCCAACCGGGAGAAA，下游CCAGAGTCCAGCACAATACCA；CTGF上游TCACTGACCTGCCTGTAG，下游GCTGAGTCTGCTGTTCTG；FN上游CATTCAACAAG AAACCACT，下游TCTGTCACTTCCACAAACT。

2.6 Western blot法檢測Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、CTGF、FN、α－SMA及Smad通路相關蛋白表達將2.2培養(yǎng)細胞，放射免疫沉淀試驗（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）法獲得細胞總蛋白，等量蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。膜封閉后，室溫下加入特異性一抗溶液孵育膜2 h，再加入酶標二抗孵育膜1 h，增強型化學發(fā)光顯色試劑顯影。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白和內(nèi)參β－actin比值表示對應蛋白表達量。

2.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。采用單因素方差分析和SNK－q檢驗分析多組間差異。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 軟肝丸含藥血清對TGF－β1誘導肝星狀細胞增殖的影響與空白組比較，TGF－β1組肝星狀細胞活力明顯升高（P＜0.05）；與TGF－β1組比較，低、中、高濃度含藥血清組肝星狀細胞活力明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 軟肝丸含藥血清抑制TGF－β1誘導肝星狀細胞增殖 （±s）

表1 軟肝丸含藥血清抑制TGF－β1誘導肝星狀細胞增殖 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

?

3.2 軟肝丸含藥血清對TGF－β1誘導肝星狀細胞凋亡的影響與空白組比較，模型組肝星狀細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，軟肝丸低、中、高濃度肝星狀細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。見圖1、表2。

表2 軟肝丸含藥血清促進TGF－β1誘導肝星狀細胞凋亡 （±s）

表2 軟肝丸含藥血清促進TGF－β1誘導肝星狀細胞凋亡 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

?

圖1 檢測軟肝丸含藥血清對TGF－β1誘導肝星狀細胞凋亡的影響

3.3 軟肝丸含藥血清對TGF－β1誘導肝星狀細胞Col－ⅠmRNA、Col－ⅢmRNA、CTGFmRNA、FNmRNA及α－SMAmRNA的影響與空白組比較，模型組肝星狀細胞Col－ⅠmRNA、Col－ⅢmRNA、CTGFmRNA、FNmRNA及α－SMAmRNA水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，軟肝丸低、中、高濃度組肝星狀細胞Col－ⅠmRNA、Col－ⅢmRNA、CTGFmRNA、FNmRNA及α－SMAmRNA水平均明顯降低（P＜0.05）。見表3。

表3 軟肝丸含藥血清抑制TGF－β1誘導肝星狀細胞Col－ⅠmRNA、Col－ⅢmRNA、CTGF mRNA、FN mRNA及α－SMA mRNA水平 （±s）

表3 軟肝丸含藥血清抑制TGF－β1誘導肝星狀細胞Col－ⅠmRNA、Col－ⅢmRNA、CTGF mRNA、FN mRNA及α－SMA mRNA水平 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

?

3.4 軟肝丸含藥血清對TGF－β1誘導肝星狀細胞Col－、Col－Ⅲ、CTGF、FN及α－SMA蛋白的影響與空白組比較，模型組肝星狀細胞Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、CTGF、FN及α－SMA蛋白表達均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，軟肝丸低、中、高濃度組肝星狀細胞Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、CTGF、FN以及α－SMA蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）。見表4、圖2。

表4 軟肝丸含藥血清抑制TGF－β1誘導肝星狀細胞Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、CTGF、FN及α－SMA蛋白表達（±s）

表4 軟肝丸含藥血清抑制TGF－β1誘導肝星狀細胞Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、CTGF、FN及α－SMA蛋白表達（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

?

圖2 肝星狀細胞Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、CTGF、FN及α－SMA蛋白表達圖

3.5 軟肝丸含藥血清對TGF－β1誘導肝星狀細胞Smad通路蛋白的影響與空白組比較，模型組肝星狀細胞p－Smad2／3蛋白表達明顯升高，Smad7蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，軟肝丸低、中、高濃度組肝星狀細胞p－Smad2／3蛋白表達顯著降低，Smad7蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。見表5、圖3。

圖3 肝星狀細胞Smad2／3、p－Smad2／3和Smad7蛋白表達

表5 軟肝丸含藥血清抑制TGF－β1誘導肝星狀細胞p－Smad2／3蛋白和促進Smad7蛋白表達（±s）

表5 軟肝丸含藥血清抑制TGF－β1誘導肝星狀細胞p－Smad2／3蛋白和促進Smad7蛋白表達（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

?

4 討論

HSCs在肝纖維化發(fā)病機制中起核心作用，肝損傷可誘導HSCs從靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)，HSCs通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）組織抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP）抑制MMP活性，引起ECM積聚并產(chǎn)生白細胞介素6（interleukin 6，IL－6）、IL－8等促炎性細胞因子及TGF－β等促纖維化因子進一步激活HSC，促進分化為成肌纖維細胞并遷移至損傷部位合成Col－Ⅰ、α－SMA促進肝纖維化形成［9－10］。本研究中TGF－β1顯著誘導LX－2細胞增殖及HSCs活化標志物α－SMA表達，抑制細胞凋亡，并促進Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、CTGF、FN等纖維化標志物產(chǎn)生，這與楊淑娟等［11］的檢測結果一致，提示LX－2細胞體外纖維化模型構建成功。

藥理研究表明，鱉甲可改善肝炎、肝硬化患者臨床癥狀，延緩病情的發(fā)展；龜甲具有免疫增強和抗氧化作用［12－13］。穿山甲具有降低血液黏度、抗炎、抗癌、消癰及鎮(zhèn)痛的作用［14］。當歸具有抑制血小板聚集、促進造血功能［15］。牡蠣可保護肝細胞膜免受脂質(zhì)過氧化損傷，抑制肝細胞凋亡［16］。桃仁提取物通過促進Ⅰ型和Ⅲ型膠原降解進而具有抗肝纖維化作用［17］。雞內(nèi)金可調(diào)節(jié)消化液分泌、提高消化酶活性，減少肝及腸系膜中脂肪堆積［18］。軟肝丸全方配伍嚴謹，具有軟堅散結、活血化瘀、益氣養(yǎng)血功效，在臨床用于治療肝纖維化、肝硬化［19－20］。馬素平等［21］研究顯示，服用軟肝丸可提高乙肝肝硬化患者人血白蛋白和膽堿酯酶水平、改善肝臟儲備功能，并降低門脈高壓癥。本研究探討軟肝丸抗纖維化作用潛在機制發(fā)現(xiàn)，軟肝丸含藥血清可促進LX－2細胞凋亡，這與孟勝喜等［7］研究發(fā)現(xiàn)一致。此外，軟肝丸含藥血清明顯阻止TGF－β1誘導的LX－2細胞增殖和活化。在正常肝臟中HSCs可通過調(diào)節(jié)ECM合成和降解可維持ECM沉積平衡，而HSCs過度激活將導致ECM大量沉積，最終導致肝組織結構破壞和功能障礙［22］。FN在膠原沉積中具有重要作用。CTGF是一種富含半胱氨酸的基質(zhì)細胞蛋白參與細胞增殖、分化、黏附、血管生成及組織纖維化等生理病理過程，通過抑制CTGF表達可抑制HSCs表型轉(zhuǎn)換進而緩解肝纖維化進展［23－24］。丹防膠囊通過降低肝組織中α－SMA、COL－Ⅰ、COL－Ⅲ蛋白表達，對大鼠肝纖維化有一定的保護作用［25］。與上述研究一致，本研究軟肝丸含藥血清可有效抑制TGFβ1誘導細胞中Col－Ⅰ、Col－Ⅲ、FN和CTGF蛋白表達，提示軟肝丸含藥血清可抑制TGF－β1誘導后LX－2細胞纖維化。綜上所述，軟肝丸含藥血清通過抑制LX－2細胞增殖、活化、ECM合成并誘導細胞凋亡進而發(fā)揮抗纖維化作用。

Smad蛋白是TGF－β1的關鍵細胞內(nèi)效應因子，Smad2和Smad3具有促肝纖維化作用，而Smad7具有保護作用［26－27］。研究表明，丹酚酸B通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）介導的Smad2／3磷酸化表現(xiàn)出顯著的抗纖維化作用［28］。二氫楊梅素通過抑制Smad2／3磷酸化可抑制HSCs活化從而抑制ECM產(chǎn)生［29］。本研究軟肝丸含藥血清可顯著降低TGF－β1誘導后p－Smad2／3表達，升高Smad7蛋白表達，提示軟肝丸含藥血清可能通過調(diào)控Smad信號通路影響LX－2細胞增殖、活化和凋亡而發(fā)揮抗纖維化作用。

綜上所述，軟肝丸可抑制TGF－β1誘導的肝星狀細胞增殖、活化和纖維化，促進細胞凋亡，其機制可能與調(diào)控Smad通路有關。這豐富了軟肝丸在肝纖維化中的保護作用，為其在預防或逆轉(zhuǎn)肝纖維化應用奠定堅實基礎。