張慕垚，譚曉慧，王振飛，耿剛

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100；2.內(nèi)蒙古腫瘤醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010

肝癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。2020年美國癌癥統(tǒng)計報告顯示，美國男性和女性的肝癌及肝內(nèi)膽管癌死亡率分別為6%和4%［1］，2018年中國男性肝癌診斷率為12.4%、死亡率為15.2%。由于病毒感染引起的肝癌得到了一定的防控［2］，但轉(zhuǎn)移率和死亡率仍然較高，嚴重威脅著人民的健康。中醫(yī)藥在抗腫瘤方面積累了豐富的臨床經(jīng)驗，中藥以多途徑、多靶點抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展，在臨床治療中優(yōu)勢突出。

香附，別名莎草、香頭草、回頭青、雀頭香、雷公頭、三棱草根等，是莎草科植物莎草的干燥根莖，主產(chǎn)于我國浙江、山東、福建、湖南、安徽一帶。味辛、微苦微甘、平，歸肝、脾和三焦經(jīng)，具有疏肝解郁、理氣寬中、調(diào)經(jīng)止痛的功效［3］，可用于治療肝郁氣滯、脅肋脹痛、脘腹疼痛、月經(jīng)不調(diào)、黃疸、疝氣等疾病。藥理研究顯示，該藥具有抗腫瘤作用［4－5］，但目前對抗腫瘤活性成分和作用的分子機制知之甚少。本研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法分析香附抗肝癌作用的活性成分，尋找活性成分的作用靶點及通路，為該藥的深度開發(fā)及抗肝癌臨床應用提供理論依據(jù)。

1 方法

1.1 香附活性成分的獲取在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到香附的全部活性成分，根據(jù)生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%和類藥性（durgliness，DL）＞0.18的條件篩選出有效活性成分。下載藥物相關(guān)的所有靶點，用Perl軟件將上述有效成分相關(guān)的靶點在所有靶點中篩出，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將已篩選出的靶點名轉(zhuǎn)換為靶點Symbol，標準化處理以便后續(xù)操作。

1.2 肝癌靶點的獲取在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：／／www.genecards.org／）中以“Liver cancer”為關(guān)鍵詞進行檢索，導出所有肝癌相關(guān)靶標，以Relevance score＞1的條件進行篩選，得到與肝癌關(guān)聯(lián)性較大的靶標。在OMIM數(shù)據(jù)庫（https：／／www.omim.org／）中Gene Map內(nèi)以“Liver cancer”為關(guān)鍵詞進行檢索，導出所有肝癌相關(guān)靶標。將兩個數(shù)據(jù)庫檢索得到的靶標匯總，摘取Symbol備用。

1.3 確定香附－肝癌的共同靶點應用韋恩圖在線 工 具（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）將1.1和1.2獲取的香附與肝癌的靶點Symbol取交集，得到香附與肝癌的共同靶點，繪制韋恩圖，保存交集文件。

1.4 香附－活性成分－肝癌－靶點關(guān)系網(wǎng)絡構(gòu)建用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建香附治療肝癌的關(guān)系網(wǎng)絡圖。打開Cytoscape導入前期準備好的相關(guān)文件，繪制網(wǎng)絡圖，調(diào)整圖片顏色格式大小等參數(shù)，導出圖片，得到“香附－活性成分－肝癌－靶點”的關(guān)系網(wǎng)絡。

1.5 PPI蛋白互作網(wǎng)絡構(gòu)建及柱狀圖繪制運用STRING（https：／／string－db.org／）在線分析軟件，找到Multiple proteins，在List Of Names中輸入香附與肝癌的靶點Symbol交集文件，物種選擇人（即Homo Sapiens），點擊search、continue，默認最小的score為0.4，得到PPI蛋白互作網(wǎng)絡圖。用R語言計算節(jié)點連線與連接基因的數(shù)目，取數(shù)目最多的前30個基因繪制柱狀圖。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析用R語言香附中有效活性成分治療肝癌的靶基因進行GO生物過程富集分析和KEGG通路富集分析，設置P＜0.05，Q＜0.05，物種為人，分析結(jié)果以柱形圖和氣泡圖的形式予以展示。

2 結(jié)果

2.1 香附活性成分及作用靶點按OB＞30%和DL＞0.18的條件篩選出的香附活性成分18個，見表1。香附所有活性成分的相關(guān)治療靶點1029個，用perl找出18個成分所作用的靶點496個，將這些靶點名在Uniprot數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)化為Symbol，得到231個靶點Symbol。

表1 香附的活性成分

2.2 香附－肝癌靶點香附活性成分作用靶點231個，刪除重復，剩余108個。由GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索整合肝癌靶點15 392個，去除重復靶點，剩余14 248個。將香附活性成分作用靶點與肝癌靶點取交集得到香附－肝癌靶點105個，見圖1。

圖1 香附靶點與肝癌靶點韋恩圖

2.3 香附－活性成分－肝癌－靶點關(guān)系網(wǎng)絡構(gòu)建運用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建香附治療肝癌的“香附－活性成分－肝癌－靶點”關(guān)系網(wǎng)絡圖，見圖2。紅色菱形表示肝癌，藍色橢圓形代表香附，黃色四邊形代表活性成分，綠色三角形表示靶點。該網(wǎng)絡共包括有效成分16個，節(jié)點105個，成分靶點間共存在333條相互作用關(guān)系。通過香附治療肝癌關(guān)系網(wǎng)絡可視化，可知香附的一種有效成分可作用于多個肝癌的靶點，同一個肝癌的靶點也可受多個有效成分調(diào)控。

圖2 香附－活性成分－肝癌－靶點關(guān)系網(wǎng)絡圖

2.4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡及柱狀圖該PPI網(wǎng)絡包含節(jié)點105個，邊937條，平均節(jié)點度17.8，平均局部聚類系數(shù)0.584，PPI富集P＜1.0e－16。網(wǎng)絡節(jié)點代表了蛋白質(zhì)，其大小和顏色的深淺代表度值大小，節(jié)點度值越大代表節(jié)點在網(wǎng)絡中越處于核心地位，邊粗細代表score大小，這里默認最小score為0.4。節(jié)點連線與連接因子數(shù)目最多的前30個因子，如圖3、圖4。節(jié)點因子鄰接的因子越多，說明該因子在網(wǎng)絡中越核心。其中白細胞介素（interleukin－6，IL－6）與周圍因子連接最多有58個，血管內(nèi)皮生長因子A和凋亡信號分子CASP3均有54個，絲裂原激活蛋白激酶8有53個，表皮生長因子受體有52個，說明香附治療肝癌與這些因子關(guān)系密切。

圖3 香附－肝癌靶點PPI蛋白互作網(wǎng)絡圖

圖4 香附－肝癌靶點PPI蛋白互作柱狀圖

2.5 GO功能富集分析圖5為GO分析的前20個結(jié)果的柱狀圖，縱坐標代表基因的生物學功能，橫坐標代表富集的基因數(shù)目；圖6為GO分析的前20個結(jié)果的氣泡圖，縱坐標代表基因的生物學功能，橫坐標代表富集的基因比例，氣泡的大小表示富集的數(shù)目。所涉及的生物學功能包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性、特異性RNA聚合酶II、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等。香附可能是通過作用影響這些關(guān)鍵生物學功能而發(fā)揮治療肝癌作用的。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

圖6 GO功能富集分析氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析圖7為KEGG分析的前20個結(jié)果的柱狀圖，縱坐標代表基因通路，橫坐標代表富集的基因數(shù)目；圖8為KEGG分析的前20個結(jié)果的氣泡圖，縱坐標代表基因通路，橫坐標代表富集的基因比例，氣泡的大小表示富集的數(shù)目。所涉及的生物學通路包括PI3K－Akt信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、MAPK信號通路、甲狀腺激素信號通路等，所涉及的生物學過程包括人巨細胞病毒感染、Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、乙型肝炎、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、細胞凋亡等，這些信號通路與生物學過程富集程度較高，說明與香附治療肝癌的作用關(guān)系密切。

圖7 KEGG通路富集分析柱狀圖

圖8 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖9 為KEGG通路分析得到的腫瘤壞死因子通路，紅色表示與香附有效活性成分作用于肝癌相關(guān)的因子或分子。

圖9 腫瘤壞死因子通路

3 討論

香附出自《名醫(yī)別錄》，李時珍曰：“《別錄》止云莎草，不言用苗用根。后世皆用其根，名香附子”。《本草簡要方》“利三焦，解六郁，平怒氣，消飲食，通一切氣”?！侗静輦湟贩Q香附“乃血中氣藥，通行十二經(jīng)”。尤可看出香附的行氣之功?！锻饪剖ā泛汀夺t(yī)方簡義》均記載了香附治療乳腺癌“敷乳巖，實時消散”“治乳癰乳巖初起者”。肝主疏泄，主藏血，喜調(diào)達而惡抑郁，肝郁則氣滯，氣滯則痰凝血瘀，日久聚而成毒形成為積聚。香附歸足厥陰肝經(jīng)，善于疏肝解郁，尤其適用于肝郁氣滯證的疾病?，F(xiàn)代醫(yī)家用香附疏肝解郁的功效配伍其他中藥治療多種惡性 腫瘤（如 肝癌、乳腺 癌）［6－9］及相關(guān) 并發(fā)癥［10－12］（如癌性胸水、抑郁癥）。

本研究得到的香附活性成分如異鼠李素、β－谷甾醇、木樨草素和槲皮素等，已經(jīng)證實這些活性成分具有抗腫瘤的作用。Cai Fangzhen等［13］研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素可通過靶向作用于線粒體依賴的內(nèi)源性凋亡生物學過程、增強間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化和抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2（MMP－2）和MMP－9的過度表達、下調(diào)癌細胞p－P13K、p－Akt和p－mTOR蛋白表達來抑制PI3K／Akt／mTOR生物學途徑，從而抑制雄激素非依賴性前列腺癌細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移。嚴寧等［14］研究發(fā)現(xiàn)，β－谷甾醇可降低大鼠血清中丙二醛、超氧化物歧化酶、活性氧等參與氧化應激，降低模型大鼠血清中IL－1β、IL－6和TNF－α的炎性因子水平，通過下調(diào)ERK1／2、上調(diào)Bcl－2／Bax，參與ERK1／2信號通路（如細胞凋亡和癌變等生物學活動）來抑制心肌缺血再灌注損傷。木樨草素也是重要的抗癌活性成分，董欣敏等［15］研究發(fā)現(xiàn)，木樨草素可抑制乳腺癌細胞MDA－MB－231的增殖并誘導其凋亡。Iva Potocnjak等［16］研究發(fā)現(xiàn)，木樨草素降低抗凋亡蛋白Bcl－2的表達、增加促凋亡蛋白Bax和caspase－3的表達來促進癌細胞凋亡，增加自噬蛋白Beclin－1、自噬相關(guān)蛋白5（Atg5）和微管相關(guān)蛋白1A／1B輕鏈3β－I／II（LC3B－I／II）的表達來促進癌細胞自噬，抑制（Wnt）／β－catenin途徑誘導上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的逆轉(zhuǎn)。槲皮素能抑制腫瘤細胞的生成和轉(zhuǎn)移，主要調(diào)節(jié)了以下幾種細胞生物學過程和傳導途徑：細胞周期停滯、細胞凋亡、NF－κB途徑、AKT／mTOR信號通路、p38MAPK信號通路和PI3K－AKT信號通路［17－19］等。本研究運用網(wǎng)絡藥理學分析得到香附通過多成分、多靶點抗肝癌的網(wǎng)絡關(guān)系，找到了IL－6、血管內(nèi)皮生長因子A、凋亡信號分子CASP3、絲裂原激活蛋白激酶8和表皮生長因子受體等關(guān)鍵的靶分子。此外，目前對金圣草（黃）素、異黃檀素、玫瑰菌素等物質(zhì)的抗癌活性還研究較少，通過藥物疾病靶點互作網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析，得知這些活性成分可能作用于ESR1、AR、PPARG、NCOA2等基因，進而參與核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性等生物學過程發(fā)揮抗肝癌的作用，這些結(jié)果可為今后研發(fā)新的抗肝癌藥物提供新的思路。

本研究通過GO功能富集分析，得到所涉及的生物學功能主要包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、RNA聚合酶II特異性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合、氧化還原酶活性、與分子氧結(jié)合或還原等。表明香附中的活性成分通過參與DNA轉(zhuǎn)錄，神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合和氧化反應等過程治療肝癌。通過KEGG的通路富集分析，主要涉及有PI3K－Akt信號通路、MAPK信號通路、AGERAGE信號通路、腫瘤壞死因子信號通路及甲狀腺激素信號通路等；主要涉及的生物學過程包括人巨細胞病毒感染、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、MicroRNAs調(diào)控、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、癌癥中的蛋白多糖等，這些病毒感染和途徑的激活與肝癌關(guān)系密切。磷脂酰肌醇－3－激酶（PI3K）／蛋白激酶B（Akt）信號通路是調(diào)節(jié)機體內(nèi)細胞生存、生長、分化及凋亡的重要信號通路，其過程是催化相關(guān)蛋白的磷酸化發(fā)揮促癌作用［20］，如miR－182可通過激活PI3K／AKT信號通路上調(diào)其相關(guān)蛋白的表達（如MMP－9、c－Myc、VEGF），從而促進肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移［21］。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）被激活后參與細胞的增殖、分化、凋亡和自噬等過程，因此MAPK信號通路作為經(jīng)典的途徑，在其相關(guān)蛋白（細胞外信號調(diào)節(jié)激酶、c－Jun氮末端激酶以及p38激酶）在磷酸化后可發(fā)揮抑癌作用［22］。乙肝病毒所表達的乙肝病毒X蛋白（HBx）可激活NF－κB通路，使轉(zhuǎn)錄因子NF－κB活化來調(diào)節(jié)肝癌細胞的遷移、侵襲［23］；還有研究發(fā)現(xiàn)，在乙肝病毒相關(guān)的肝細胞肝癌患者的腫瘤樣品中觀察到miR－200c低表達［24］。研究證實，人巨細胞病毒感染與惡性腫瘤相關(guān)［25］，如人巨細胞病毒感染可能通過STAT3信號通路上調(diào)內(nèi)皮細胞特異性分子的表達促進膠質(zhì)瘤的發(fā)展［26］；人巨細胞病毒的US28基因可能激活HIF－1α途徑、調(diào)節(jié)下游遷移及侵襲基因表達從而促進結(jié)腸癌細胞的遷移、侵襲［27］。流體剪切應力是通過血液在血管中持續(xù)流動，對血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生剪切力，激活膜感受器和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導（如核因子κB、MAPK、血小板內(nèi)皮黏附分子等）而調(diào)控基因表達，從而影響血管內(nèi)皮細胞的功能來調(diào)節(jié)血管張力、血液黏附性、凝血和纖溶間的平衡等［28］，從改變血液循環(huán)方面改善腫瘤微環(huán)境。

本研究具體展示了腫瘤壞死因子通路分析圖（如圖8），腫瘤壞死因子與細胞膜上腫瘤壞死因子受體結(jié)合，作用于TRADD蛋白（TRAF2／5和R1P1），與銜接蛋白（TAB1／2／3）和轉(zhuǎn)化生長因子激酶1（TAK1）磷酸化MKK4／7和MKK3／6；MKK4／7使JNK1／2蛋白磷酸化作用于激活子蛋白－1（AP－1）參與DNA的轉(zhuǎn)錄。TAB1／2／3和TAK1還可以使IKKβ磷酸化，激活核轉(zhuǎn)錄因子NF－κB和Tp12，進而磷酸化MEK1，使細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1／2）磷酸化，通過MSK1／2作用于基因轉(zhuǎn)錄蛋白CREB參與DNA的轉(zhuǎn)錄。DNA轉(zhuǎn)錄進一步調(diào)控IL－6、Nfkbia基因、Fos等因子的表達，影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。而香附的有效活性成分作用于IKKβ、NF－κB、JNK1／2蛋白和AP－1發(fā)揮對肝癌的治療作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法得到香附共16個有效活性成分作用于108個靶點，有105個靶點與肝癌的靶點有交集，構(gòu)建了香附－活性成分－肝癌－靶點關(guān)系可視化網(wǎng)絡（成分靶點間共存在333條相互作用關(guān)系）和PPI蛋白互作可視化網(wǎng)絡（節(jié)點105個，邊937條），通過GO功能富集和KEGG通路富集分析找到香附治療肝癌涉及的相關(guān)生物學功能和通路并進行注釋，提示香附通過多靶點、多通路發(fā)揮抗肝癌的作用，證明了在中醫(yī)學理論的指導下中藥抗癌的科學性。