岳霞 孫雅麗 楊小敏 宋海燕 賀雯

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，β淀粉樣蛋白(β amyloid，Aβ)聚集及細(xì)胞內(nèi)的Tau蛋白的磷酸化是其主要病理改變[1]。根據(jù)Aβ毒性蛋白的發(fā)病機(jī)制，研發(fā)靶向Aβ的治療藥物，以期為AD靶向藥物的研發(fā)提供新的方向[2]。黃連素，又稱小檗堿(berberine，BR)是從黃連中提取的一種天然的異喹啉類生物堿，研究表明，黃連素具有抗炎、抑制膽堿酯酶活性、抑制Aβ蛋白聚集和Tau蛋白的過(guò)度磷酸化等作用[3]。研究報(bào)道黃連素可增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)傳遞，改善腦血流量，保護(hù)神經(jīng)元免受炎癥，限制Tau的過(guò)度磷酸化并促進(jìn)β-淀粉樣肽清除[4]。黃連素能明顯改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，減少Aβ42的表達(dá)和老年斑的形成[5]。但黃連素對(duì)阿爾茨海默病影響的機(jī)制還尚不清楚。研究表明miRNA參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，與AD的發(fā)病有關(guān)[6]。研究報(bào)道AD患者中miR-19b-3p表達(dá)水平降低，miR-19b-3p的血清水平是AD的有用生物標(biāo)志物[7]。高表達(dá)miR-19b-3p可能通過(guò)調(diào)節(jié)BACE1的表達(dá)改善AD患者的認(rèn)知功能[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用Aβ處理PC12細(xì)胞，建立AD細(xì)胞模型，研究黃連素對(duì)AD細(xì)胞模型的影響及其是否與miR-19b-3p有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細(xì)胞購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自廣州弗爾博生物科技有限公司；β淀粉樣蛋白(β Amyloid，Aβ)購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司；黃連素購(gòu)自廈門研科生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)購(gòu)自杭州仟諾生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠(Annexin V-FITC/PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞處理與分組

1.2.1 將PC12細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，10 μmol/L的Aβ處理建立阿爾茨海默癥模型細(xì)胞，記為Aβ組，無(wú)任何處理的細(xì)胞作為對(duì)照(NC)組；分別用0.1、1.0、10.0 μmol/L黃連素和10 μmol/L的Aβ處理PC12細(xì)胞，記為0.1 μmol/L 黃連素+Aβ組、1.0 μmol/L 黃連素+Aβ(黃連素+Aβ)組、10.0 μmol/L黃連素+Aβ組。

1.2.2 將miR-NC、miR-19b-3p轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后再用10 μmol/L的Aβ處理，記為miR-NC+Aβ組、miR-19b-3p+Aβ組；將miR-NC、miR-19b-3p轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞后再用1.0 μmol/L 黃連素和10 μmol/L的Aβ處理，記為黃連素+miR-NC+Aβ組、黃連素+miR-19b-3p+Aβ組。

1.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 選擇各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，每孔中加入10 μl CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD)。以O(shè)D值代表細(xì)胞增殖活性。

1.4 蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)法檢測(cè)CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。按照40 μg/孔上樣蛋白，經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后，洗膜，加入稀釋好的一抗(1∶500稀釋)，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜，加入按照1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色，暗室下X線膠片顯影、定影。Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值。蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的PBS漂洗2次，與500 μl的結(jié)合緩沖液混勻。先加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)miR-19b-3p表達(dá)水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。miR-19b-3p以U6為內(nèi)參，miR-19b-3p上游引物序列：5’-GTGCAAATCCATGCAAAACTGA-3’，下游引物序列：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTGCT-3’；U6上游引物序列：5’-TCGGCAGCACATATACTAA-3’，下游引物序列：5’-ATGGAACGCTTCACGAAT-3’。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度黃連素對(duì)Aβ處理PC12細(xì)胞增殖的影響 與NC組比較，Aβ組細(xì)胞OD值和CyclinD1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與Aβ組相比，不同濃度黃連素組細(xì)胞OD值和CyclinD1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 不同濃度黃連素對(duì)Aβ處理PC12細(xì)胞增殖的影響

圖1 Western Blot檢測(cè)CyclinD1蛋白的表達(dá)

2.2 黃連素對(duì)Aβ處理PC12細(xì)胞凋亡的影響(黃連素：1.0 μmol/L ) 與對(duì)照組比較，Aβ組Cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與Aβ組比較，黃連素+Aβ組Cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 黃連素對(duì)Aβ處理PC12細(xì)胞凋亡的影響;A 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡;B Western Blot檢測(cè)Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

表2 黃連素對(duì)Aβ處理PC12細(xì)胞凋亡的影響

2.3 黃連素對(duì)miR-19b-3p表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，Aβ組miR-19b-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與Aβ組相比，黃連素+Aβ組miR-19b-3p表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 黃連素對(duì)miR-19b-3p表達(dá)的影響

2.4 miR-19b-3p對(duì)Aβ處理PC12細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與對(duì)照組比較，Aβ組miR-19b-3p表達(dá)水平顯著降低，CyclinD1表達(dá)水平顯著降低，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞OD值顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與miR-NC+Aβ組相比，miR-19b-3p+Aβ組miR-19b-3p表達(dá)水平顯著升高，CyclinD1表達(dá)水平顯著升高，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞OD值顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4，圖3。

圖3 Western Blot檢測(cè)CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

表4 miR-19b-3p對(duì)Aβ處理PC12細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.5 黃連素聯(lián)合miR-19b-3p對(duì)Aβ處理PC12細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與黃連素+Aβ組和黃連素+miR-NC+Aβ組相比，黃連素+miR-19b-3p+Aβ組miR-19b-3p表達(dá)水平顯著升高，CyclinD1表達(dá)水平顯著升高，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞OD值顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表5，圖4。

圖4 Western Blot檢測(cè)CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

表5 黃連素聯(lián)合miR-19b-3p對(duì)Aβ處理PC12細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3 討論

有研究報(bào)道黃連素可改善三重轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默氏病小鼠的空間學(xué)習(xí)能力和記憶力，還可以減輕Tau的過(guò)度磷酸化[9]。黃連素可能通過(guò)活化Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡[10]。黃連素可通過(guò)lncRNA β-淀粉樣蛋白裂解酶1反義RNA(β-amyloid cleaving enzyme 1 antisense RNA，BACE1-AS)/miR-132-3p軸保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受Aβ25-35的侵害[11]。以上研究結(jié)果表明黃連素具有改善AD的作用。本實(shí)驗(yàn)用黃連素處理Aβ作用的PC12細(xì)胞，結(jié)果顯示，CyclinD1表達(dá)水平顯著升高，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞OD值顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低。說(shuō)明黃連素可減弱Aβ作用的PC12細(xì)胞損傷。

研究報(bào)道，肌萎縮性側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)也是一種致命的神經(jīng)退行性疾病，miR-19b-3p在ALS患者中也下調(diào)表達(dá)[12]。miR-19b-3p過(guò)表達(dá)減弱了Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力抑制和細(xì)胞凋亡促進(jìn)，是治療阿爾茨海默氏病的保護(hù)劑[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中miR-19b-3p表達(dá)水平顯著降低，過(guò)表達(dá)miR-19b-3p可促進(jìn)Aβ作用的PC12細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。研究報(bào)道天然產(chǎn)物抗人通過(guò)調(diào)控miRNA和自噬延緩阿爾茨海默病的進(jìn)展[14-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃連素處理后Aβ作用的PC12細(xì)胞中miR-19b-3p表達(dá)水平顯著升高。本實(shí)驗(yàn)為研究黃連素是否與miR-19b-3p聯(lián)合起作用，本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染miR-19b-3p的過(guò)表達(dá)載體的同時(shí)用黃連素處理，結(jié)果顯示， 黃連素聯(lián)合miR-19b-3p也可顯著的抑制Aβ作用的PC12細(xì)胞凋亡。

綜上所述，黃連素聯(lián)合miR-19b-3p減輕了Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，對(duì)阿爾茨海默病模型細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。