王艷春 李昶

肺癌是一種惡性程度較高的腫瘤，是威脅人群生命健康最大的惡性腫瘤之一[1]。近幾十年來許多的國家都報(bào)道肺癌的發(fā)病率和病死率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和病死率均占所有惡性腫瘤的第一位[2]。肺癌的發(fā)生與長期大量吸煙有著非常密切的關(guān)系，有研究表明，長期吸煙的肺癌患者比不吸煙者患上肺癌的概率是10～20倍，隨著吸煙者的年齡越小，患肺癌的概率越高[3]。城市中大量的煙塵和大氣中含致癌污染物，也是導(dǎo)致患上肺癌的因素之一，因此尋找一個(gè)有效治療肺癌的臨床治療具有重要意義[3]。本文研究中，上調(diào)微小信使核糖核酸-564(miR-564)對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響研究，具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料 研究細(xì)胞：非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，購于上海北諾生物科技有限公司，貨號l100800。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。主要試劑：TLR-4(上?？泼羯锟萍加邢薰?，貨號：H00007099-G01；MyD88(深圳市豪地華拓生物科技有限公司)，貨號：251418；IκBα(上海江萊生物科技有限公司)；CyclinD1(武漢博歐特生物科技有限公司)，貨號：orb77046；P21(北京百奧萊博科技有限公司)，貨號：K23376-XGJ；MTT試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)，貨號：JKSJ-1812；流式細(xì)胞儀(常州必達(dá)科生物科技有限公司)，貨號：1026；Transwell小室(上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組處理:選取細(xì)胞分為空白組、下調(diào)組、上調(diào)組，空白組不做任何處理，對下調(diào)組、上調(diào)組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。取下調(diào)組、上調(diào)組2組細(xì)胞，將培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫，培養(yǎng)基回溫后噴以70%的乙醇并擦拭，輕搖冷凍管2 min其全部融化，移入無菌操作臺內(nèi)。測量出細(xì)胞的濃度，將細(xì)胞種植于六孔板內(nèi)，每個(gè)六孔板大約種植細(xì)胞4×105細(xì)胞，加至新鮮的培養(yǎng)基中(10 ml)進(jìn)行培養(yǎng)。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞孵育到融合率在40%～80%時(shí)，取1.5 μl的質(zhì)粒DNA溶于100 μl的雙抗培養(yǎng)基中(不含血清)，之后進(jìn)行充分混合，混合均勻后進(jìn)行離心處理至EP管底，在EP管中加入12 μl的PolyFectReagent，進(jìn)行上下重復(fù)顛倒3次，進(jìn)行混勻處理，靜置在室溫環(huán)境下，靜置時(shí)間約為3～6 min，對轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成起到促進(jìn)作用，吸去置于六孔板中的培養(yǎng)基，將新鮮的完全培養(yǎng)基加入(10 ml)，在含有轉(zhuǎn)染復(fù)合體的EP管中加入含有血清和雙抗的600 μl完全培養(yǎng)基，上下重復(fù)顛倒2次，在加入六孔板中進(jìn)行水平搖晃，以促進(jìn)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的均勻分布。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行常規(guī)的換液處理，再次繼續(xù)24 h的培養(yǎng)，使用熒光顯微鏡下對熒光亮度進(jìn)行觀察，對細(xì)胞進(jìn)行收集，提取細(xì)胞RNA，鑒定轉(zhuǎn)染效率，將轉(zhuǎn)染效率最高的質(zhì)粒組、空載組稀釋液接種于10 mm2培養(yǎng)皿中，選取經(jīng)過PCR驗(yàn)證篩選的細(xì)胞進(jìn)行消化處理后稀釋，稀釋后接種在24孔板中，最終建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的miR-564下調(diào)組、miR-564上調(diào)組。

1.2.2 細(xì)胞增殖、凋亡能力、細(xì)胞周期分布檢測:MTT法檢測細(xì)胞增殖用含有10%胎小牛血清培養(yǎng)液配單個(gè)細(xì)胞懸液，細(xì)胞按7×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔體積200 μl，同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)2～4 d，培養(yǎng)2～4 d 后，每孔加入MTT繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)清液。每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min。選擇570 nm波長，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸收值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、周期分布，收集細(xì)胞樣本，細(xì)胞數(shù)量<10×105個(gè)。并將細(xì)胞在37℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，用冷PBS洗滌細(xì)胞1次，再用200～500 μl冷PBS重懸細(xì)胞。加入200 μl PI染液，搖晃混勻后4℃，避光常溫環(huán)境中4 h，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果的最大激發(fā)波長為488 nm。

1.2.3 細(xì)胞侵襲檢測:使用檢測細(xì)胞侵襲能力，用無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基洗細(xì)胞3次，配制細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為5×105/ml，于Transwell小室的上室中加入不同的細(xì)胞懸液200 μl，每組選3個(gè)復(fù)孔，在37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，HE染色計(jì)數(shù)，在光學(xué)顯微鏡下觀察穿過膜的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞增長到90%時(shí)，使用200 μl的移液器槍頭,垂直劃出3條直線。之后經(jīng)過PBS緩沖液進(jìn)行清洗2～3次，分別加入0.5%的血清培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)24 h，使用光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞的遷移變化。

1.2.5 CyclinD1、P21、TLR-4、MyD88、IκBα蛋白表達(dá)檢測:采用Western Blot檢測，使用PBS清洗細(xì)胞，測定蛋白的濃度。100℃加熱處理5 min促使蛋白變性，SDS蛋白緩沖液后電泳進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，搖床上常溫封閉1 h；采用DAB染色試劑盒顯色，光密度掃描版進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖、凋亡能力比較 下調(diào)組在24、48、72 h,細(xì)胞增殖率均高于空白組，上調(diào)組細(xì)胞增殖率低于空白組和下調(diào)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)組在24、48、72 h，細(xì)胞凋亡率低于空白組，上調(diào)組細(xì)胞凋亡率高于空白組和下調(diào)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表1。

表1 3組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖、凋亡能力比較

空白組下調(diào)組上調(diào)組

2.2 3組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較 下調(diào)組侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)均高于空白組和上調(diào)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上調(diào)組侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)均低于空白組和下調(diào)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖2。

空白組下調(diào)組上調(diào)組

表2 3組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較 個(gè),

2.3 3組TLR4/NF-κB通路TLR-4、MyD88、IκBα表達(dá)比較 下調(diào)組TLR-4、MyD88、IκBα表達(dá)均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組TLR-4、MyD88、IκBα表達(dá)低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組TLR-4、MyD88、IκBα表達(dá)低于下調(diào)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 3組TLR4/NF-κB通路蛋白TLR-4、MyD88、IκBα表達(dá)比較

圖3 TLR-4、MyD88、IκBα表達(dá)WB圖

2.4 3組細(xì)胞周期分布情況比較 下調(diào)組細(xì)胞處于G1、S、G2期的比例低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組細(xì)胞處于G1期的比例均高于空白組處于S、G2期比例低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組細(xì)胞處于G1期的比例高于下調(diào)組S、G2期比例低于下調(diào)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組細(xì)胞周期分布情況比較

2.5 3組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、P21表達(dá)比較 下調(diào)組CyclinD1高于空白組，P21低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組CyclinD1低于空白組，P21高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；上調(diào)組CyclinD1低于下調(diào)組，P21高于下調(diào)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5，圖4。

表5 3組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、P21表達(dá)比較

圖4 CyclinD1、P21表達(dá)WB圖

3 討論

近年來我國患惡性腫瘤的人群明顯升高，肺癌的主要病理組織分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌兩大類，肺癌患者病理分型中絕大部分是非小細(xì)胞肺癌，給患者及其家屬帶來日常生活、生命健康等影響[4，5]。肺癌患者往往早期無癥狀或癥狀不明顯，肺癌患者一旦出現(xiàn)病癥、體征已是肺癌晚期，臨床對肺癌患者治療效果并不令人滿意，對非小細(xì)胞肺癌患者要早期發(fā)現(xiàn)，早診斷治療[6，7]。在本文研究中，上調(diào)微小RNA-564對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，效果有顯著改善。

臨床研究顯示[8，9]，肺癌的發(fā)生與多種miRNA表達(dá)異常相關(guān)，經(jīng)調(diào)控異常表達(dá)的miRNA可抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，促進(jìn)凋亡。微小mRNA-564屬于miRNA家族成員之一，其在臨床上被證實(shí)在肺癌中表達(dá)異常，且與肺癌疾病進(jìn)展密切相關(guān)[10]。鑒于此，在本文中分析調(diào)控微小mRNA-564對肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果顯示，上調(diào)mRNA-564能讓非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞抑制癌細(xì)胞增殖，癌細(xì)胞凋亡率升高[11]。調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵是G1期向S期進(jìn)展，細(xì)胞中多種蛋白共同參與[12]。研究顯示，CyclinD1在G1期向S期進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，G1期合成水平相對較高。P21通過抑制CyclinD1蛋白表達(dá)，有助于抑制癌細(xì)胞從G1期向S期進(jìn)展。在本文中，上調(diào)組CyclinD1蛋白表達(dá)降低，P21蛋白表達(dá)升高，說明上調(diào)微小mRNA-564通過調(diào)控CyclinD1、P21蛋白表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞周期阻滯[13]。上調(diào)miR-564阻滯細(xì)胞周期分布，在G1期，能夠讓癌細(xì)胞凋亡。上調(diào)mRNA-564阻滯癌細(xì)胞周期分布促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡有重要意義，CyclinD1能促進(jìn)細(xì)胞增殖，CyclinD1通過結(jié)合并激活G1時(shí)期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，G1期周期抑制蛋白被磷酸化，磷酸化的蛋白從其所結(jié)合E2F轉(zhuǎn)錄因子起轉(zhuǎn)錄活細(xì)胞周期的基因，從而推動細(xì)胞周期有G1時(shí)期進(jìn)入到S時(shí)期[14]。因此上調(diào)mRNA-564能夠阻滯癌細(xì)胞的周期，對癌細(xì)胞凋亡有一定的作用[15]。上調(diào)mRNA-564對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的侵襲、遷移有著密切關(guān)系，在本文研究中，通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的侵襲、遷移能力進(jìn)行測驗(yàn)，上調(diào)mRNA-564對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)量減少，說明上調(diào)mRNA-564能夠抑制A549細(xì)胞的侵襲、遷移的作用。A549細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，促進(jìn)凋亡與細(xì)胞通路蛋白表達(dá)變化有密切聯(lián)系[16，17]。TLR-4為氣道上皮細(xì)胞以及肺泡巨噬細(xì)胞中重要的免疫受體，可識別一系列病原體相關(guān)分子模體，通過TLR-4/MyD88依賴的信號鏈，啟動相應(yīng)的免疫防御反應(yīng)。MyD88是Toll樣受體信號通路中的一個(gè)關(guān)鍵接頭分子，在傳遞上游信息和疾病發(fā)生中具有重要的作用。IκBα是發(fā)現(xiàn)于成熟B細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，具有淋巴細(xì)胞特異性，在各個(gè)細(xì)胞中均有表達(dá)。IκBα抑制肺癌細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期，在血管生成、細(xì)胞遷移、免疫激活等方面具有重要作用[18-20]。

綜上所述，上調(diào)微小mRNA-564經(jīng)調(diào)控TLR-4、MyD88、IκBα蛋白的表達(dá)，抑制增殖、侵襲、遷移，促進(jìn)凋亡，經(jīng)調(diào)控CyclinD1、P21蛋白表達(dá)阻滯細(xì)胞周期分布。