木尼拉·馬哈德 哈斯也提·艾力 帕麗達(dá)·帕拉哈提

結(jié)直腸癌是一種發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤。近年來(lái)隨著生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，結(jié)直腸癌患者的預(yù)后生存率得到一定的提高，但仍是導(dǎo)致人類(lèi)死亡率的主要原因之一[1]。臨床上大部分患者確診時(shí)，已錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間，導(dǎo)致預(yù)后較差[2]。分子靶向治療具有較強(qiáng)的特異性以及較小的不良反應(yīng)，因此成為提高結(jié)直腸癌患者預(yù)后的研究重點(diǎn)。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類(lèi)含18～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可通過(guò)結(jié)合于特定基因3，端非翻譯區(qū)(Untranslated region，3，UTR)，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程，影響細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生命過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。miR-3182是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種 miRNA，其在結(jié)直腸癌組織中異常表達(dá)，但其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響還未知[3,4]。為探究miR-3182在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用以及分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平進(jìn)行研究，探討miR-3182對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及調(diào)控機(jī)制，以期為結(jié)直腸癌病理演進(jìn)分子機(jī)制的進(jìn)一步闡釋提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要材料 結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116、SW480、SW620)購(gòu)自北納生物有限公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR(Quantitative polymerase chain reaction,qPCR)購(gòu)自南京凱基生物有限公司，噻唑藍(lán)(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)購(gòu)自美國(guó)Bio Basic Inc公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，miR-3182 模擬物以及對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物有限公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-BRAD公司，7500熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng) 結(jié)直腸癌多種細(xì)胞系(HCT116、SW480、SW620)采用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育，倒置顯微鏡觀察結(jié)直腸癌細(xì)胞系生長(zhǎng)狀態(tài)，每2～3天加入胰酶消化、傳代。

1.3 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 選取對(duì)數(shù)期SW620細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、miR-NC組、miR-3182組。在Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)指示下，miR-NC組、miR-3182組分別將對(duì)照質(zhì)粒和miR-3182組模擬物轉(zhuǎn)染入SW620細(xì)胞中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，對(duì)照組為正常培養(yǎng)的SW620細(xì)胞。

1.4 qPCR實(shí)驗(yàn) 采用Trizol試劑提取對(duì)照組、miR-NC組、miR-3182組SW620細(xì)胞中總RNA，加入反轉(zhuǎn)錄試劑合成cDNA。以GAPDH為參照，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件設(shè)置為95℃ 5 min，95℃ 15 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。其中，miR-3182引物以及GAPDH引物由上海生工合成。見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.5 MTT實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)照組、miR-NC組、miR-3182組SW620細(xì)胞，將(1～3)×103個(gè)SW620細(xì)胞接種于96孔板，37℃分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔SW620細(xì)胞中加入無(wú)血清培養(yǎng)基200 μl以及MTT(5 mg/ml) 20 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔SW620細(xì)胞加入二甲基亞砜(Dimethyl sulphoxide,DMSO)150 μl，37℃孵育10 min，振蕩15 min，酶標(biāo)儀在570 nm測(cè)定吸光值，記為A值。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)照組、miR-NC組、miR-3182組轉(zhuǎn)染24 h的SW620細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，Transwell小室膜中預(yù)先覆蓋Matrigel基質(zhì)膠稀釋液(1∶5 DMEM培養(yǎng)基稀釋)，而細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)Transwell小室無(wú)需覆蓋Matrigel基質(zhì)膠。將200 μl含有2×105個(gè)SW620細(xì)胞浮液加入Transwell上室，另外將600 μl含10%胎牛血清培養(yǎng)基加入下室，37℃培養(yǎng)24 h；棉花輕輕擦拭Transwell上室，甲醛固定、染色各30 min，拍照、計(jì)數(shù)5個(gè)區(qū)域細(xì)胞，取平均值。

1.7 靶基因的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證 采用在線數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測(cè)miR-3182下游靶基因，選取與腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)的基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)作為研究對(duì)象。雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-3182與Bcl-2的靶向關(guān)系，野生型(Bcl-2-wt)和突變型(Bcl-2-mut)Bcl-2的3，-UTR熒光素酶報(bào)告載體由上海吉?jiǎng)P生物有限公司構(gòu)建，并分別與miR-3182 模擬物和對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，37℃培養(yǎng)48 h，收集SW620細(xì)胞，測(cè)定雙熒光素酶的相對(duì)活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-3182在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)量 與人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞(FHC)相比，miR-3182在結(jié)直腸癌多種細(xì)胞系(HCT116、SW480、SW620)中表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中在SW620細(xì)胞中的表達(dá)量相對(duì)較低。見(jiàn)表2。

表2 miR-3182在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)量

2.2 miR-3182模擬物對(duì)miR-3182表達(dá)量的影響 與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒對(duì)SW620細(xì)胞中miR-3182表達(dá)量無(wú)顯著影響，但miR-3182模擬物可顯著增加SW620細(xì)胞中miR-3182表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 miR-3182模擬物對(duì)miR-3182表達(dá)量的影響

2.3 上調(diào)miR-3182對(duì)SW620細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒對(duì)SW620細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響，但miR-3182模擬物隨著時(shí)間的增加顯著抑制SW620細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 上調(diào)miR-3182對(duì)SW620細(xì)胞增殖的影響

2.4 上調(diào)miR-3182對(duì)細(xì)胞侵襲、遷移的影響 與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒對(duì)SW620細(xì)胞遷移、侵襲無(wú)顯著影響，但miR-3182模擬物顯著抑制SW620細(xì)胞遷移、侵襲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5，圖1。

表5 上調(diào)miR-3182對(duì)SW620細(xì)胞侵襲、遷移的影響 個(gè),

圖1 上調(diào)miR-3182對(duì)SW620細(xì)胞遷移、侵襲的影響(×200)

2.5 miR-3182靶基因的預(yù)測(cè) Bcl-2 3，UTR區(qū)域(4654-4661)部分堿基可特異性結(jié)合于miR-3182，表明Bcl-2可能是miR-3182的潛在靶基因。見(jiàn)圖2。

圖2 Targetscan預(yù)測(cè)miR-3182下游靶基因

2.6 miR-3182靶向調(diào)控Bcl-2 miR-3182模擬物與Bcl-2-wt共轉(zhuǎn)染較miR-NC組與Bcl-2-wt共轉(zhuǎn)染顯著降低SW620細(xì)胞的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但miR-3182模擬物與Bcl-2-mut共轉(zhuǎn)染與miR-NC組與Bcl-2-mut共轉(zhuǎn)染對(duì)SW620細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)明顯變化。見(jiàn)表6。

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

3 討論

結(jié)直腸癌的病理演進(jìn)過(guò)程是一個(gè)多階段、多基因參與的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程。在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，多個(gè)原癌基因以及抑癌基因的表達(dá)量發(fā)生明顯變化。早期研究證實(shí)，在結(jié)直腸癌組織生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中，miRNA的表達(dá)量發(fā)生異常變化[5,6]。miRNA可靶向調(diào)節(jié)多種在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程具有重要作用的基因，通過(guò)降解或者抑制其翻譯，影響其表達(dá)量，從而參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等過(guò)程。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-3182參與結(jié)直腸癌進(jìn)展，具有抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的能力。值得注意的是，其作用機(jī)制可能與靶向調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)緊密相關(guān)，為結(jié)直腸癌分子機(jī)制的深入研究提供了新的啟示。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miR-3182在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，表達(dá)量發(fā)生顯著變化，并且調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)特性[7-10]。miR-3182在不同類(lèi)型的癌癥中起著抑癌或致癌的功能[11-14]，例如，與匹配的癌旁組織或正常成骨細(xì)胞系相比，miR-3182在骨肉瘤組織或細(xì)胞系中的表達(dá)量顯著下調(diào)，可通過(guò)調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)水平抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和腫瘤生長(zhǎng)，進(jìn)而產(chǎn)生抑制腫瘤的作用。在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miR-3182表達(dá)量明顯增加，有助于鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，可作為預(yù)后監(jiān)測(cè)的潛在分子標(biāo)記物[15]。在三陰性乳腺癌中，miR-3182的表達(dá)量降低，通過(guò)靶向調(diào)節(jié)mTOR和S6K1的表達(dá)量，影響腫瘤組織的生長(zhǎng)。在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-3182在結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116、SW480、SW620)中的表達(dá)量降低，與梁高鋒等[7,16]的報(bào)道一致，這也表明miR-3182參與結(jié)直腸癌病理演進(jìn)過(guò)程。其中在結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞中的表達(dá)量相對(duì)降低，因此將SW620細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象。此前已有資料顯示，在結(jié)直腸癌中，梁高鋒等[7]利用高通量測(cè)序檢測(cè)到miR-3182表達(dá)量明顯降低，但其具體的作用尚不十分清楚。為進(jìn)一步探究miR-3182的具體作用，本研究將miR-3182模擬物轉(zhuǎn)染入SW620細(xì)胞中，qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果發(fā)現(xiàn)，miR-3182模擬物可顯著上調(diào)SW620細(xì)胞中miR-3182的表達(dá)量，說(shuō)明成功構(gòu)建上調(diào)miR-3182的細(xì)胞；MTT和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上調(diào)miR-3182的表達(dá)量明顯抑制SW620細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，與前人報(bào)道[14]相符，提示miR-3182在結(jié)直腸癌病理演進(jìn)過(guò)程中發(fā)揮抑癌基因的作用。

Bcl-2是一種常見(jiàn)的癌基因，在腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用，有效抑制細(xì)胞的凋亡[17]。研究表明，Bcl-2是細(xì)胞多種凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的共同樞紐，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18-20]。為進(jìn)一步探究miR-3182調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)以及雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，Bcl-2是miR-3182的下游靶基因，表明miR-3182可能通過(guò)靶向調(diào)控Bcl-2影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。

綜上所述，miR-3182在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中表達(dá)量降低；上調(diào)miR-3182顯著抑制SW620細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，其作用機(jī)制可能是通過(guò)靶向影響B(tài)cl-2表達(dá)量；但本實(shí)驗(yàn)僅在細(xì)胞水平探究miR-3182的作用以及潛在分子機(jī)制，未來(lái)會(huì)在多株細(xì)胞系以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究miR-3182的具體作用，為結(jié)直腸癌的分子靶向治療提供潛在標(biāo)志物。