張晶 代思華 王曉巖 谷麗彩 黃蕊 任常軍

膿毒癥是指由感染因素引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致器官功能障礙[1]。膿毒癥相關(guān)性腦病(sepsis-associated encephalopathy,SAE)是膿毒癥患者嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。主要表現(xiàn)為為記憶力下降，注意力不集中，定向障礙，易激惹，精神恍惚甚至昏迷等不同程度的認(rèn)知功能障礙。其發(fā)病機(jī)制可能與腦血管功能障礙、氨基酸及神經(jīng)遞質(zhì)異常、炎性損傷、氧化刺激和谷氨酸興奮毒性等有關(guān)[2]。在膿毒癥介導(dǎo)的腦損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程中伴隨多種基因、RNA、蛋白的表達(dá)改變和功能異常，而有效調(diào)節(jié)這些異常的分子表達(dá)可能減輕膿毒癥介導(dǎo)的腦損傷。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)和微小RNA(microRNAs)同屬于非編碼RNA，其異常表達(dá)及相互作用在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可能是膿毒癥新的治療靶點(diǎn)[3,4]。結(jié)直腸腫瘤差異表達(dá)(colorectal neoplasia differentially expressed,CRNDE)是結(jié)直腸腫瘤差異表達(dá)長(zhǎng)鏈非編碼RNA，在許多癌組織和癌細(xì)胞中表達(dá)出現(xiàn)異常[5,6]。miRcroRNA-126-5p (miR-126-5p)由人類染色體轉(zhuǎn)錄的前體RNA剪切而來(lái)，miR-126-5p作為微小RNA在宮頸癌、非小細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)[7,8],然而，CRNDE和miR-126-5p在膿毒癥患兒腦損傷中作用的研究較少。本研究研究CRNDE在膿毒癥患兒腦損傷中的功能和作用機(jī)制，為臨床上治療膿毒癥患兒相關(guān)性腦損傷提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2019年1月本院收治的30例膿毒癥誘導(dǎo)腦損傷患兒作為研究對(duì)象，其中男11例，女19例；年齡2個(gè)月～10歲，平均(4.51±1.63)歲。同時(shí)，健康對(duì)照組30例，均為同期本院兒童保健科體檢的健康兒童，其中男12例，女18例；年齡2個(gè)月～10歲，平均(5.19±2.14)歲。在研究開始之前，所有參與者家長(zhǎng)簽署了知情同意書，并經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過(guò)。

1.2 試劑與儀器 TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitogen公司，DMEM和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Biological Industries公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司，雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司，RNA提取試劑盒和定量PCR試劑盒SYBR premix Ex TaqTM購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)資料[9]培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞。取1～2 d新生的C57小鼠，小心分離出大腦皮質(zhì)腦組織，采用適量0.125%的胰蛋白酶消化腦組織，后用10%FBS的完全培養(yǎng)基終止消化，離心后加入適量20%FBS的完全培養(yǎng)基重懸腦組織，按照每個(gè)T75培養(yǎng)瓶接種10 ml懸液的量接種，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24～36 h后棄培養(yǎng)基，用無(wú)菌DMEM培養(yǎng)基輕柔洗滌2次，連續(xù)培養(yǎng)10～12 d后，在光學(xué)顯微鏡下可見大量折光性強(qiáng)的細(xì)胞，以200 r/min的速度在37℃恒溫?fù)u床上連續(xù)搖晃30 min，使強(qiáng)折光細(xì)胞脫落；倒掉培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，加入適量10%完全培養(yǎng)基重懸并接種到細(xì)胞板中并待用；留在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞絕大多數(shù)為星形膠質(zhì)細(xì)胞，采用上述方法搖晃細(xì)胞3次，以去除殘留的小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，加0.25%胰蛋白酶消化并接種后留用。采用10 μg/ml LPS(Sigma,St.Louis,MO,USA)處理HSAECs細(xì)胞24 h，刺激體外LPS誘導(dǎo)膿毒癥模型。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將經(jīng)LPS處理的HSAECs細(xì)胞以 5×106/cm2接種于6孔板，保證轉(zhuǎn)讓時(shí)細(xì)胞匯合度>80%。miR-195-5p mimics，miR-195-5p inhibitors，CASC9過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，sh-CASC9購(gòu)于廣州RiboBio Co,Ltd.(Guangzhou,China)。轉(zhuǎn)染操作嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000(Invitrogen,California,USA)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 從組織和細(xì)胞中提取RNA，采用Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,按操作說(shuō)明進(jìn)行將RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。根據(jù)制造商的說(shuō)明，RT-RCR是在ABI 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上與SYBR premix EX TAQ II一起進(jìn)行的。以GAPDH和U6為內(nèi)參分別檢測(cè)CRNDE和miR-126-5p的表達(dá)水平，并用2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)。其中:CRNDE的引物序列正向：5’-GAGGACGTGCTGGGGCT-3’,反向 5’-CTGAGTCCATGTCCCGAATC-3’；miR-126-5p的引物序列是正向5′-ACACTCCAGCTGGGTCGTACCGT-GAGTAAT-3’，反向5’-TGGTGTCGTG-GAGTCG-3’；內(nèi)參U6的引物序列是正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。內(nèi)參GAPDH的引物序列是正向5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’，反向5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因法 野生型CRNDE及突變型CRNDE的目的片段被構(gòu)建并整合入pGL3 vector (Promega,Madison,WI,USA)以構(gòu)建 pGL3-CRNDE-wild type (CRNDE-wt)和pGL3-CRNDE-mutant (CRNDE-mut) reporter vector。將CRNDE-wt或CRNDE-mut與miR-126-5p mimics或陰性對(duì)照物共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，檢測(cè)熒光素酶活性。每組各設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.7 MTT法 第1天將星形膠質(zhì)細(xì)胞種在96孔培養(yǎng)板中(5×103細(xì)胞/孔)，第2天細(xì)胞密度達(dá)到約70%時(shí)，按LipofactamineTM2000說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別在轉(zhuǎn)染24 h進(jìn)行MTT檢測(cè)。每孔加入MTT(5 g/L)10 μl，繼續(xù)孵育4 h，棄培養(yǎng)液后再加入甲基亞砜(DMSO)，避光振蕩10 min至結(jié)晶充分溶解，空白對(duì)照調(diào)零，并用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處吸光度值。

1.8 免疫印跡(Western Blot) 免疫印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)的B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)和BCL2-Associated X蛋白(Bax)，以及NF-κB、Keap1、Nrf2的表達(dá)情況。將轉(zhuǎn)染的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，加入RIPA裂解重懸細(xì)胞，超聲破碎、1 200 r/min，4℃條件下離心10 min，按照BCA試劑盒(Thermo, Shanghai, China)說(shuō)明書測(cè)定總蛋白濃度。每個(gè)樣本取30 μg經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF上。5%脫脂牛奶封閉PVDF膜60 min，加入相應(yīng)比例的一抗Anti-Bcl-2 antibody (ab196495, Abcam,1∶1 000)、Anti-Bax antibody (WL01637，Wanleibio, 1∶1 000)，Anti-NFkB p105/p50 antibody (ab32360, Abcam, 1∶1 000)、Anti-Keap1 antibody(ab196346，Abcam，1∶1 000)、Anti-Nrf2 antibody(ab137550, Abcam ，1∶1 000) 4℃下過(guò)夜，洗膜后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育120 min，滴加顯影液顯影，觀察條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。GAPDH為內(nèi)參。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 肺組織稱重后，加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液進(jìn)行勻漿，4℃下14 000 g離心25 min，留取上清液。ELISA試劑盒(Invitrogen,Waltham,MA,USA)分別檢測(cè)細(xì)胞上清液腫瘤壞死因子TNF-α(tumornecro sisfactor，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、氧化應(yīng)激因子(SOD、MDA)的含量，嚴(yán)格按試劑盒要求操作，具體步驟：(1)包被過(guò)程(設(shè)置空白對(duì)照，陰性對(duì)照)：將所用抗原用包被稀釋液稀釋到適當(dāng)濃度，每孔抗原加入100 μl,置37℃，4 h，棄去孔中液體。(2)封閉酶標(biāo)反應(yīng)孔：5%小牛血清置37℃封閉40 min。封閉時(shí)將封閉液加滿各反應(yīng)孔；封閉結(jié)束后用洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3 min。(3)加入待檢細(xì)胞上清液：將稀釋好的細(xì)胞上清液加入酶標(biāo)反應(yīng)孔中，每樣品至少加3孔，每孔100 μl，置于37℃，60 min。然后，用洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3 min。(4)加入酶標(biāo)抗體：根據(jù)說(shuō)明書稀釋，每孔加100 μl ，37℃，40 min。然后，用洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3 min。(5)加入底物液(現(xiàn)用現(xiàn)配)：每孔100 μl，置37℃避光放置5 min。(6)終止反應(yīng)：加入終止液顯色，每孔加入終止液50 μl終止反應(yīng),于20 min內(nèi)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(7)結(jié)果判斷：酶標(biāo)儀于490 nm讀取吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 在膿毒癥腦損傷患兒血清中CRNDE下調(diào)，而miR-126-5p上調(diào) RT-PCR結(jié)果顯示，在膿毒癥患兒血清中CRNDE的水平顯著下調(diào)(P<0.01)，而miR-126-5p的水平上調(diào)(P<0.01)。見表1。

表1 2組CRNDE和miR-126-5p表達(dá)水平比較

2.2 上調(diào)CRNDE對(duì)LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響 LPS顯著降低了星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞中CRNDE的表達(dá)水平(P<0.05)。我們采用MTT法檢測(cè)了10 μg/ml LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)24 h的吸光度值，結(jié)果顯示，在LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CRNDE后，星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖水平上調(diào)(P<0.05)。見表2、3。

表2 RT-PCR檢測(cè)星型膠質(zhì)細(xì)胞CRNDE的表達(dá)水平

表3 RT-PCR和MTT法檢測(cè)LPS誘導(dǎo)的星型膠質(zhì)細(xì)胞CRNDE的表達(dá)水平

2.3 上調(diào)CRNDE對(duì)LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響 在探究了上調(diào)CRNDE對(duì)LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響后，我們探究了上調(diào)CRNDE對(duì)LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響，Western blot結(jié)果顯示，上調(diào)LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中CRNDE的水平后，細(xì)胞中Bax的水平顯著下調(diào)，而Bcl2的水平上調(diào)。見圖1。

圖1 LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.4 上調(diào)CRNDE對(duì)炎性因子和氧化應(yīng)激因子的影響 為了進(jìn)一步探究CRNDE在膿毒癥腦損傷中的作用，我們檢測(cè)了LPS介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子(TNF-α、IL-1β)、炎癥相關(guān)蛋白(NF-κB)、氧化應(yīng)激因子(SOD、MDA)、氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白(Keap1、Nrf2)的水平。ELISA和western blot結(jié)果顯示，上調(diào)CRNDE后，LPS介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、NF-κB、MDA、Keap1的水平下調(diào)，而SOD和Nrf2的水平上調(diào)(P<0.05)。見表4，圖2。

圖2 LPS介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥、氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

表4 ELISA法檢測(cè)LPS介導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥、氧化應(yīng)激相關(guān)因子的水平

2.5 CRNDE靶向miR-126-5p 為了進(jìn)一步探究CRNDE調(diào)控AHI的下游分子機(jī)制，我們通過(guò)StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.starbase.com)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，數(shù)據(jù)顯示CRNDE含有miR-126-5p的保守結(jié)合位點(diǎn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CRNDE與miR-126-5p的結(jié)合關(guān)系，我們采用雙熒光素酶報(bào)告法進(jìn)行檢測(cè)。雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)表明，miR-126-5p模擬物可降低含CRNDE-wt的熒光素酶報(bào)告體的熒光素酶活性，而對(duì)CRNDE-mut載體的熒光素酶活性沒有顯著影響(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)顯示CRNDE含有miR-126-5p的保守結(jié)合位點(diǎn)

表5 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)驗(yàn)證CRNDE與miR-126-5p的結(jié)合關(guān)系

3 討論

膿毒癥介導(dǎo)的腦損傷由多種炎性介質(zhì)和效應(yīng)細(xì)胞共同調(diào)控，其潛在機(jī)制是肺巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)度表達(dá)的促炎性細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫紊亂[10]。核因子-κB(NF-κB)能調(diào)節(jié)多種參與缺血再灌注損傷的細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、黏附分子的基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而控制它們的生物合成，在炎性反應(yīng)中起著非常關(guān)鍵的作用[11]。有研究表明，膿毒癥多器官功能障礙及損傷時(shí)常伴有NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上調(diào)活化[12]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)膿毒癥ALI大鼠血清中TNF-α、IL-1β表達(dá)水平顯著上調(diào)，NF-κB活性明顯升高，這與以往報(bào)道一致。此外，膿毒癥不僅與炎性反應(yīng)有關(guān)，而且與活性氧(ROS)的產(chǎn)生和抗氧化因子表達(dá)失衡有關(guān)[13,14]。

Keap1(Kelch-like ECH-as-sociated protein 1)是一種細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，Nrf2-Keap1是機(jī)體氧化應(yīng)激系統(tǒng)重要的信號(hào)通路[15]。生理狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2和Keap1相結(jié)合并處于相對(duì)抑制狀態(tài)而不會(huì)從胞漿進(jìn)入胞核內(nèi)激活下游信號(hào)，當(dāng)受到ROS和親電子刺激，發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2和Keap1解離，Nrf2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)與下游ARE結(jié)合，啟動(dòng)ARE下游的抗氧化蛋白或促氧化蛋白合成酶等基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)以抵抗內(nèi)外界的有害刺激[16]。

在本研究中觀察到，在膿毒癥患兒血清中中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA顯著上調(diào)，SOD下調(diào)，氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Keap1上調(diào)，而Nrf2下調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了膿毒癥可以介導(dǎo)顯著的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

研究報(bào)道,高表達(dá)lncRNA NEAT1與膿毒癥患者的風(fēng)險(xiǎn)增加、預(yù)后不良、促炎細(xì)胞因子的高表達(dá)顯著相關(guān)[17]。有趣的是，lncRNA Lethe在膿毒癥腦損傷中表達(dá)下調(diào)，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元的自噬減弱膿毒癥介導(dǎo)的腦損傷[18]。近年來(lái)，CRNDE在炎癥的進(jìn)展中發(fā)揮了重要的作用，例如，CRNDE通過(guò)上調(diào)WI-38細(xì)胞中的FOXM1加速了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥[19]。在本研究中，我們首先發(fā)現(xiàn)CRNDE抑制膿毒癥相關(guān)性腦損傷的進(jìn)展。

在脾巨噬細(xì)胞中miR-146a可減弱炎癥和膿毒癥引起的多器官損傷[20]。厚樸醇通過(guò)靶向調(diào)節(jié)miR-218-5p/血紅素加氧酶-1信號(hào)通路減輕膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷[21]。miR-126-5p通過(guò)抑制慢性HIV-1感染中的圓柱狀瘤，增強(qiáng)單核細(xì)胞對(duì)脂多糖刺激的炎性反應(yīng)[22]。在本研究中，我們首先發(fā)現(xiàn)miR-126-5p在膿毒癥患兒血清和LPS作用的星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，而過(guò)表達(dá)miR-126-5p可以顯著抑制肝上皮細(xì)胞的增殖并促進(jìn)肝上皮細(xì)胞的凋亡，提示miR-126-5p可以加快盲腸結(jié)扎穿孔致膿毒癥介導(dǎo)的肝損傷的進(jìn)程。

最近，lncRNAs通過(guò)與miRNAs相互作用并抑制其作用而起到ceRNA或miRNA sponge的作用。例如，在膿毒癥中，lncRNA NEAT1可以通過(guò)靶向抑制miR-125增加MCEMP1(mast cell-expressed membrane protein 1,MCEMP1)的表達(dá)對(duì)膿毒癥小鼠的免疫抑制發(fā)揮促進(jìn)作用，這可能是膿毒癥治療的潛在靶標(biāo)[23]。此外，LncRNA HOTAIR可通過(guò)下調(diào)miR-34a/Bcl-2信號(hào)通路抑制腎組織細(xì)胞凋亡，從而減輕膿毒癥大鼠的AKI[24]。此外，有研究表明，CRNDE靶向調(diào)節(jié)miR-181a-5p促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[25]；lncRNA HOTAIR作為一種競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA，通過(guò)靶向抑制miR-126-5p促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展[26]。我們探究了CRNDE與miR-126-5p的潛在相互作用。相關(guān)數(shù)據(jù)證明了CRNDE可能是LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的miR-126-5p sponge。

綜上所述，我們的研究首次證明CRNDE在膿毒癥腦損傷患兒血清和LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。功能性實(shí)驗(yàn)證實(shí)CRNDE通過(guò)調(diào)節(jié)miR-126-5p減弱膿毒癥腦病，是一個(gè)有價(jià)值和有前景的膿毒癥患兒腦損傷治療靶點(diǎn)。