張秀梅 周永華 叢林 劉曙 石明 蘇建軍

乳腺癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率與死亡率逐年上升，非編碼RNA在基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，有研究表明微小RNA(microRNA，miRNA)可通過(guò)靶mRNA結(jié)合而調(diào)控基因表達(dá)從而抑制其翻譯過(guò)程，并可調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等過(guò)程[1,2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)在乳腺癌等腫瘤中異常表達(dá)，并可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及遷移[3,4]。因而探討LncRNA/miRNA在乳腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制有助于提高乳腺癌治療效果及改善患者預(yù)后。長(zhǎng)鏈非編碼RNA MAPKAPK5-AS1(Long non-coding RNA MAPKAPK5-AS1，LncRNA MAPKAPK5-AS1)在肺癌細(xì)胞中表達(dá)量升高，并可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞侵襲能力及抑制細(xì)胞凋亡[5]。但MAPKAPK5-AS1在乳腺癌細(xì)胞發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制尚未完全闡明。通過(guò)生物信息學(xué)分析顯示微小RNA-96(microRNA-96，miR-96)可能是MAPKAPK5-AS1的靶基因，研究表明miR-96在乳腺癌、胃癌等腫瘤中異常表達(dá)，并可調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等過(guò)程[6,7]。但MAPKAPK5-AS1是否可通過(guò)調(diào)控miR-96的表達(dá)從而參與乳腺癌細(xì)胞發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程尚未可知。因此，本研究探討MAPKAPK5-AS1、miR-96在乳腺癌組織中的表達(dá)及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移的影響，探究MAPKAPK5-AS1對(duì)miR-96的靶向調(diào)控作用，為乳腺癌早期診斷及治療提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 乳腺癌組織及癌旁組織：選取2017年2月至2018年10月我院收治的乳腺癌患者41例為研究對(duì)象，患者均經(jīng)病理證實(shí)為乳腺癌，平均年齡(56.35±8.57)歲，患者均接受手術(shù)治療，于術(shù)中切除乳腺癌組織及癌旁組織，放入液氮中保存，術(shù)后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情且簽署同意書(shū)。

1.1.2 試劑：乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM減血清培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine2000與Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；MAPKAPK5-AS1小分子干擾RNA(si-MAPKAPK5-AS1)、亂序無(wú)意義陰性序列(si-NC)、miR-96寡核苷酸模擬物(miR-96 mimics)及陰性對(duì)照mimic NC序列(miR-NC)、miR-96特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-96)及陰性對(duì)照(anti-miR-NC)購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；RIPA裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(electrochemiluminescence，ECL)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗人增殖標(biāo)記蛋白細(xì)胞增殖核抗原67(Antigen identified by monoclonal antibody，Ki67)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；兔抗人神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組:MDA-MB-468細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液接種于96孔板(3×105個(gè)/孔)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)將培養(yǎng)基更換為Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，參照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將si-NC、si-MAPKAPK5-AS1、miR-NC、miR-96 mimics、si-MAPKAPK5-AS1與anti-miR-NC、si-MAPKAPK5-AS1與anti-miR-96轉(zhuǎn)染至MDA-MB-468細(xì)胞，分別記作si-NC組、si-MAPKAPK5-AS1組、miR-NC組、miR-96組、si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-NC組、si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-96組，各組轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)MAPKAPK5-AS1、miR-96的表達(dá)水平:取出凍存乳腺癌組織、癌旁組織及各組轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-468細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度與純度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。MAPKAPK5-AS1正向引物5’-CGGCACATGGATCTTTCAGG-3’，反向引物5’-TGGCAGAAGGAGTAACAGCA-3’；miR-96正向引物5’-TTTTGCTTGTGTC TCTCCGC-3’，反向引物5’-TCATACGCTACGACTGGCAT-3’；U6正向引物5’-GCTTCGG CAGCACATATACT-3’，反向引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；GAPDH正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40次循環(huán)。MAPKAPK5-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-96以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算MAPKAPK5-AS1、miR-96相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-468細(xì)胞接種于48孔板，按照“1.2.1”分組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，棄舊培養(yǎng)基，PBS洗滌，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個(gè)/ml，按照每孔200個(gè)細(xì)胞接種于12孔板，繼續(xù)培養(yǎng)，直至出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)細(xì)胞克隆的形成，移除培養(yǎng)液，PBS洗滌，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，清水清洗，風(fēng)干，置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移:取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-468細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/ml，按照每孔200 μl的密度將細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，Transwell小室的下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液(600 μl)，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)MAPKAPK5-AS1的靶基因:starBase預(yù)測(cè)顯示MAPKAPK5-AS1與miR-96存在靶向關(guān)系，將含有結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn)的序列片段分別插入熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建野生型載體WT-MAPKAPK5-AS1、突變型載體MUT-MAPKAPK5-AS1，分別將WT-MAPKAPK5-AS1、MUT-MAPKAPK5-AS1與miR-NC、miR-96 mimics共轉(zhuǎn)染至MDA-MB-468細(xì)胞，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá):取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-468細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉，孵育一抗稀釋液(1∶1 000)，4℃孵育24 h，TBST洗滌，孵育二抗稀釋液(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加ECL顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 MAPKAPK5-AS1在乳腺癌中的表達(dá) 與癌旁組織比較，乳腺癌組織中MAPKAPK5-AS1的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 MAPKAPK5-AS1在乳腺癌中的表達(dá)

2.2 抑制MAPKAPK5-AS1對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞增殖及遷移的影響 與si-NC組比較，si-MAPKAPK5-AS1組細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著減少(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，Ki67、N-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 Western Blot法檢測(cè)Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表達(dá)

表2 抑制MAPKAPK5-AS1對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞增殖及遷移的影響

2.3 miR-96過(guò)表達(dá)對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞增殖及遷移的影響 與miR-NC組比較，miR-96組細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著減少(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，Ki67、N-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

圖2 Western Blot法檢測(cè)Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白的表達(dá)

表3 miR-96過(guò)表達(dá)對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞增殖及遷移的影響

2.4 MAPKAPK5-AS1靶向miR-96 starBase預(yù)測(cè)顯示MAPKAPK5-AS1與miR-96存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。見(jiàn)圖3。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型載體WT-MAPKAPK5-AS1的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與miR-NC組比較，miR-96組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；共轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-MAPKAPK5-AS1的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-96組熒光素酶活性與miR-NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3，表4。

圖3 MAPKAPK5-AS1的序列中含有與miR-96互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5 抑制miR-96能減輕抑制MAPKAPK5-AS1對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞增殖的抑制作用 與si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-NC組比較，si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-96組細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著增多(P<0.05)，Ki67蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表5。

圖4 Western Blot法檢測(cè)Ki67蛋白的表達(dá)

表5 抑制miR-96能減輕抑制MAPKAPK5-AS1對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞增殖的抑制作用

2.6 抑制miR-96能減輕抑制MAPKAPK5-AS1對(duì)MDA-MB-468細(xì)胞遷移的抑制作用 與si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-NC組比較，si-MAPKAPK5-AS1+anti-miR-96組遷移細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.05)，N-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表6，圖5。

圖5 Western Blot法檢測(cè)N-cadherin、E-cadherin蛋白的表達(dá)

表6 抑制miR-96能減輕抑制MAPKAPK5-AS1對(duì)MDA-MB-468遷移的抑制作用

3 討論

LncRNA不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性吸附miRNA而調(diào)控其靶基因表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)過(guò)程，既往研究顯示LncRNA在乳腺癌中異常表達(dá)并可能作為乳腺癌診斷及治療的潛在靶標(biāo)[8-10]。但仍有部分LncRNA在乳腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制尚未闡明。

MAPKAPK5-AS1在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá)并可通過(guò)抑制P21的表達(dá)從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖[11]。沉默MAPKAPK5-AS1表達(dá)可顯著抑制肺腺癌細(xì)胞增殖[12,13]。本研究結(jié)果顯示MAPKAPK5-AS1在乳腺癌結(jié)果顯示抑制MAPKAPK5-AS1表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著減少，提示抑制MAPKAPK5-AS1表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。研究表明Ki67在腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。本研究結(jié)果顯示抑制MAPKAPK5-AS1表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞中Ki67表達(dá)下調(diào)，提示抑制MAPKAPK5-AS1表達(dá)可能通過(guò)抑制Ki67表達(dá)從而減弱乳腺癌細(xì)胞增殖能力。本研究結(jié)果顯示抑制MAPKAPK5-AS1表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少，提示抑制MAPKAPK5-AS1表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞遷移。研究表明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，其中E-cadherin屬于上皮表型標(biāo)志物，N-cadherin屬于間質(zhì)型標(biāo)志物，E-cadherin在腫瘤中表達(dá)下調(diào)可促使N-cadherin等間質(zhì)型標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲[15]。本研究結(jié)果顯示抑制MAPKAPK5-AS1表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞中N-cadherin表達(dá)下調(diào)，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，提示抑制MAPKAPK5-AS1表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控EMT從而抑制乳腺癌細(xì)胞遷移。

miR-96在慢性粒細(xì)胞白血病中呈低表達(dá)，并可靶向BCR-ABL1表達(dá)從而抑制慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)展[16]。研究表明LncRNA TP53TG1通過(guò)充當(dāng)miR-96的海綿分子從而促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)展[17]。相關(guān)報(bào)道指出抑制LncRNA MALAT1表達(dá)可通過(guò)上調(diào)miR-96的表達(dá)從而抑制急性髓樣白血病細(xì)胞增殖[18]。本研究結(jié)果顯示MAPKAPK5-AS1可靶向調(diào)控miR-96的表達(dá)及活性，進(jìn)一步研究顯示miR-96過(guò)表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移，并可促進(jìn)E-cadherin表達(dá)及抑制Ki67、N-cadherin表達(dá)，提示miR-96過(guò)表達(dá)可減弱乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移能力。本研究將si-MAPKAPK5-AS1與anti-miR-96轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖能力與遷移能力顯著增強(qiáng)，說(shuō)明抑制miR-96表達(dá)可減弱抑制MAPKAPK5-AS1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移的作用。提示抑制MAPKAPK5-AS1表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)miR-96表達(dá)從而減弱乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移。

綜上所述，乳腺癌組織中MAPKAPK5-AS1表達(dá)量升高，抑制MAPKAPK5-AS1表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移，其作用機(jī)制可能是通過(guò)靶向調(diào)控miR-96的表達(dá)而發(fā)揮作用，可為乳腺癌的診斷及治療提供潛在靶點(diǎn)。