田姍 江海 劉慧 曹霞 張丹 牟尚東 李曾

宮頸癌是一種惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率呈升高趨勢，已成為繼乳腺癌之后威脅女性生命健康的第二大惡性癌癥[1,2]。手術(shù)、化療、放療是宮頸癌的常用治療方法，但其對機(jī)體傷害較大，且腫瘤易復(fù)發(fā)、患者不良反應(yīng)較重[3]，因此尋找治療宮頸癌的有效手段、提高患者生活質(zhì)量已成臨床研究的熱點。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等生理過程，并影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[4]。miR-375是一種腫瘤抑制因子，可參與宮頸癌等多種腫瘤的生物學(xué)過程[5]。人同源盒基因1(human homeobox gene 1，OTX1)也參與多種腫瘤的增殖、遷移等惡性生物學(xué)過程[6]，但miR-375靶向調(diào)控OTX1表達(dá)參與宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、侵襲、遷移過程，筆者還未見報導(dǎo)。本研究探討miR-375靶向調(diào)控OTX1表達(dá)參與宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、侵襲、遷移過程，以期為臨床宮頸癌治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 宮頸癌HeLa細(xì)胞株(廠家：北京索萊寶科技有限公司，貨號：SCC-112011-1)。

1.2 主要試劑與儀器 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號14966005)均購自于美國ThermoFisher公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號K1622)購自于美國Fermentas公司；Trizol軸提取試劑盒(貨號46301)購自于美國Sigma公司；熒光素酶活性試劑盒(貨號E2920)購自于美國promega公司；熒光素酶報告載體由上漢恒生物公司提供；miR-375激動劑(miR-375 mimic)由英國Cohesion Biosciences公司提供(貨號：CMH0171)；miR-375抑制劑(miR-375 inhibitor)由江蘇百奧邁科生物技術(shù)有限公司提供(貨號：hsa-miR-375)；LipoGene 2000 Star Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒(貨號： L7002)由蘇州宇恒生物科技有限公司提供；鼠抗人單克隆細(xì)胞增殖核抗原(nuclcar-associated antigen，Ki-67)抗體(貨號sc-23900)、鼠抗人單克隆金屬蛋白酶組織抑制物-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)抗體(貨號sc-21735)均購于美國Santa Cruz公司；兔抗人多克隆基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinases-2，MMP-2)抗體(貨號ab97779)、兔抗人多克隆人同源盒基因1(Orthodenticlehomeobox 1，OTX1)抗體(貨號ab25985)均購于美國abcam公司。酶標(biāo)儀(型號SpectraMax iD3)購自于上海美谷分子儀器有限公司；電泳儀(型號1658001)購自于美國Bio-Rad公司；實時熒光定量PCR儀(型號ABI9700)購自于美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng):人宮頸癌HeLa細(xì)胞株常規(guī)復(fù)蘇后，接種于RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含1%雙抗，10% FBS)，置于37℃，0.5%的CO2孵育箱中培養(yǎng)，2～3 d換液，待細(xì)胞融合至80%時，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min離心3 min，收集細(xì)胞沉淀，制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)并接種后，收集對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.2 轉(zhuǎn)染及分組:取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，常規(guī)消化離心后，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105/ml接種于6孔板，每孔2 ml，細(xì)胞分5組，空白對照組(Control組)、miR-375 激動劑陰性對照組(mNC)組、miR-375激動劑組(miR-375 mimic組)，miR-375抑制劑劑組(miR-375 inhibitor組)，miR-375抑制劑陰性對照組(iNC組)；Control組細(xì)胞不做任何處理，使其自然生長，mNC和miR-375 mimic組分別轉(zhuǎn)染miR-375 mimic NC和miR-375 mimic，iNC組和miR-375 inhibitor組分別轉(zhuǎn)染miR-375 inhibitor NC和miR-375 inhibitor；轉(zhuǎn)染方法按LipofectamineTM2000試劑盒說明書進(jìn)行，5組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞以備后續(xù)實驗。

1.3.3 MTT檢測細(xì)胞增殖:取對數(shù)期HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/ml，按200 μl/孔鋪于96孔板，每組8個復(fù)孔，按照1.3.2中5組細(xì)胞處理方法，4組細(xì)胞均在24 h、48 h、72 h時，加入20 μl MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加150 μl DMSO震蕩溶解后，用酶標(biāo)儀測定波長為490 nm處5組細(xì)胞的吸光度值(OD值)，并計算5組細(xì)胞的增殖率，細(xì)胞增率=實驗組OD/空白組OD×100%。

1.3.4 Transwell檢測HeLa細(xì)胞侵襲:收集1.3.2項下各組細(xì)胞，常規(guī)消化離心，以無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105/ml，取200 μl加入Matrigel處理后的Transwell上室中，24孔板下室加入完全培養(yǎng)基500 μl，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，擦拭Matrigel和上室殘留細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.2%結(jié)晶紫染色10 min，PBS清洗，風(fēng)干后在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察并記錄穿膜細(xì)胞數(shù)。侵襲率=實驗組穿膜細(xì)胞平均數(shù)/空白組穿膜細(xì)胞平均數(shù)×100%。

1.3.5 細(xì)胞劃痕檢測宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移:將1.3.2項下4組細(xì)胞，調(diào)整密度為2.5×105個/ml，每孔2 ml 接種于6孔板，第2天用300 μl無菌槍頭于6孔板底部垂直制造細(xì)胞劃痕，確保每個孔內(nèi)劃痕寬度一致，PBS清洗3次繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取樣拍照，細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕區(qū)域?qū)挾?拍照時間劃痕區(qū)域?qū)挾?/0 h劃痕寬度×100%。

1.3.6 qRT-PCR檢測宮頸癌HeLa細(xì)胞中miR-375、OTX1 mRNA相對表達(dá)水平:取1.3.2項下5組細(xì)胞，使用Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對RNA合成cDNA，按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件95℃預(yù)變性15 min、95℃變性10 s、56℃退火20 s、72℃延伸50 s，40個循環(huán)，以U6、GAPDH為對照，采用2-ΔΔCt法分析miR-375、OTX1 mRNA相對表達(dá)水平。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.7 Western Blot檢測OTX1、Ki-67、MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá):取1.3.2項下5組細(xì)胞，置于冰水浴并加入含PMSF的RIPA裂解液，提取蛋白，BCA法蛋白定量，按照4∶1在蛋白中加5×的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱3～5 min，置于-20℃保存。按照SDS-PAGE凝膠配方表制備10%分離膠和5%濃縮膠，以每泳道30 μg蛋白上樣，蛋白凝膠電泳，根據(jù)蛋白marker切膠，轉(zhuǎn)膜，對抗體OTX1、Ki67、MMP-2、TIMP-2均按照1∶500的比例稀釋后4℃孵育過夜，TBST清洗，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育并放搖床2 h，TBST清洗，參考ECL發(fā)光液說明書對條帶孵育、曝光、顯影。以Image J軟件分析5組細(xì)胞蛋白相對表達(dá)水平。

1.3.8 雙熒光素報告基因檢測miR-375與OTX1的靶向關(guān)系:合成含OTX1的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)的miR-375識別序列，克隆至pmiRGlo載體，得到pmiRGlo-OTX1-3’UTR-WT。另外對miR-375識別區(qū)OTX1堿基進(jìn)行突變連接至pmiRGlo載體，得到得到pmiRGlo-OTX1-3’UTR-MUT，分別將pmiRGlo-OTX1-3’UTR-WT、pmiRGlo-OTX1-3’UTR-MUT質(zhì)粒與miR-375 NC、miR-375 mimics共轉(zhuǎn)染，分為miR-375NC+OTX1-3’UTR-WT組、miR-375 mimics+OTX1-3’UTR-WT組、miR-375NC+OTX1-3’UTR-MUT組、miR-375 mimics+OTX1-3’UTR-MUT組，24 h后按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書添加螢火蟲和海參熒光素酶試劑上機(jī)檢測。每孔的數(shù)值以螢火蟲熒光活性/海參熒光活性顯示，試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 5組HeLa細(xì)胞增殖率比較 與Control組、mNC組及iNC組相比，miR-375 inhibitor組細(xì)胞24、48、72 h增殖率均升高(P<0.05)，miR-375 mimic組細(xì)胞增殖率降低(P<0.05)；與miR-375 inhibitor組相比，miR-375 mimic組細(xì)胞增殖率降低(P<0.05)。見表1。

表1 5組細(xì)胞增殖率比較

2.2 5組HeLa細(xì)胞侵襲率比較 與Control組、mNC組及iNC組相比，miR-375 inhibitor組細(xì)胞侵襲率升高(P<0.05)，miR-375 mimic組細(xì)胞侵襲率顯著降低(P<0.05)；與miR-375 inhibitor組相比，miR-375 mimic組細(xì)胞中侵襲率降低(P<0.05)；Control組、mNC組及iNC組間相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖1。

空白對照組mNC組iNC組miR-375 inhibitor組miR-375 mimic組

表2 對宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲能力比較

2.3 5組宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移率比較 與Control組、mNC組、iNC組相比，miR-375 inhibitor組細(xì)胞遷移率升高(P<0.05)，miR-375 mimic組細(xì)胞遷移率降低(P<0.05)；miR-375 inhibitor組相比，miR-375mimic組細(xì)胞遷移率顯著降低(P<0.05)，Control組、mNC組及iNC組各組間相比(P>0.05)。見圖2，表3。

Control組mNC組iNC組miR-375 inhibitor組miR-375 mimic組

表3 5組宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移能力比較

2.4 5組HeLa細(xì)胞中miR-375、OTX1 mRNA相對表達(dá)水平比較 與Control組、mNC組、iNC組相比，miR-375 inhibitor組miR-375表達(dá)降低(P<0.05)，OTX1 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)，miR-375 mimic組miR-375表達(dá)升高(P<0.05)，OTX1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。與miR-375 inhibitor組相比，miR-375 mimic組miR-375表達(dá)升高(P<0.05)，OTX1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。Control組、mNC組及iNC組各組間相比(P>0.05)。見表4。

表4 5組細(xì)胞中miR-375、OTX1 mRNA相對表達(dá)水平比較

2.5 5組HeLa細(xì)胞OTX1、MMP-2、Ki67、TIMP-2蛋白相對表達(dá)水平的影響 與Control組、mNC組、iNC組相比，miR-375 inhibitor組細(xì)胞OTX1、MMP-2、Ki67蛋白表達(dá)水升高(P<0.05)，TIMP-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，miR-375 mimic組細(xì)胞OTX1、MMP-2、Ki67蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)，TIMP-2蛋白表達(dá)水升高(P<0.05)；與miR-375 inhibitor組相比，miR-375mimic組細(xì)胞OTX1、MMP-2、Ki67蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，TIMP-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；Control組、mNC組及 iNC組各組間相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5，圖3。

表5 5組宮頸癌HeLa細(xì)胞OTX1、MMP-2、Ki67、TIMP-2相對表達(dá)水平比較

圖3 5組HeLa細(xì)胞中OTX1、MMP-2、Ki67、TIMP-2 蛋白表達(dá)免疫印跡情況

2.6 miR-375與OTX1的靶標(biāo)關(guān)系 TarBase v.8數(shù)據(jù)庫預(yù)測OTX1 3’-UTR與miR-375 mRNA的3’UTR區(qū)存在結(jié)合位點。與miR-375 NC+WT-OTX1 3’-UTR組比較，miR-375 mimic+WT-OTX1 3’-UTR組熒光素酶相對活性顯著降低(P<0.05)；miR-375 NC+MUT-OTX1 3’-UTR組、miR-375 mimic+MUT-OTX1 3’-UTR組熒光素酶相對活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4，表6。

圖4 TarBase v.8數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-375與OTX1基因存在結(jié)合位點圖

表6 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-375與OTX1靶向關(guān)系

3 討論

腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等惡性生物學(xué)行為，嚴(yán)重影響患者的生存和預(yù)后，而探究腫瘤惡性生物學(xué)過程的分子機(jī)制，尋找有效的抑制腫瘤產(chǎn)生與惡化的方法、提高癌癥患者生存率一直是臨床研究的重點和難點[7,8]。

miR-375可多種癌細(xì)胞中表達(dá)，并影響癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡過程[9,10]。Mao等[11]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞中miR-375表達(dá)較低，而上調(diào)miR-375表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖；Xie等[12]發(fā)現(xiàn)miR-375在肝癌組織表達(dá)水平明顯低于正常組織，且與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-375參與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程。OTX1與胚胎發(fā)育有關(guān)[14]，但近年來研究發(fā)現(xiàn)OTX1也參與多種腫瘤的惡性生物學(xué)的過程，Yang等[6]發(fā)現(xiàn)OTX1高表達(dá)，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖；Qin等[15]研究發(fā)現(xiàn)OTX1是胃癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子，而敲除OTX1基因可抑制胃癌細(xì)胞增殖；Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)降低OTX1蛋白表達(dá)可抑制影響肝癌細(xì)胞增殖和遷移。本研究用miR-375 激動劑和抑制劑處理子宮內(nèi)膜癌HeLa細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，與Control組、mNC組、iNC組相比，miR-375 inhibitor組miR-375表達(dá)增高、OTX1 mRNA及蛋白表達(dá)降低，而細(xì)胞增殖、侵襲、遷移也相對增高，反之miR-375 mimic組miR-375表達(dá)降低、OTX1 mRNA及蛋白表達(dá)升高，而細(xì)胞增殖、侵襲、遷移卻明顯降低，提示miR-375低表達(dá)，OTX1高表達(dá)可促進(jìn)HeLa細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。而雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)，miR-375與OTX1存在結(jié)合位點，WT-miR-375 mimic+OTX1 3’-UTR組的熒光素酶相對活性低于WT-miR-375 NC+OTX1 3’-UTR組，表明miR-375過表達(dá)可靶向抑制OTX1表達(dá)，抑制腫瘤的增殖、侵襲、遷移。

Ki67與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物[17]；St lhammar等[18]發(fā)現(xiàn)乳腺癌病理級別越高，Ki67蛋白表達(dá)越高，其腫瘤有絲分裂及增殖活性越高。MMP-2可促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲，而TIMP-2可抑制MMP-2分泌，抑制腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲[19]，Chien等[20]發(fā)現(xiàn)在三陰性乳腺癌細(xì)胞中，抑制TIMP-2表達(dá)，MMP-2及MMP-9表達(dá)增高，癌細(xì)胞侵襲及遷移活性明顯增強。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control組、mNC組、iNC組相比，miR-375 inhibitor組Ki67、MMP-2蛋白表達(dá)增高、TIMP-2蛋白表達(dá)降低進(jìn)一步表明miR-375高表達(dá)可靶向抑制OTX1表達(dá)，抑制增殖、侵襲、遷徙相關(guān)分子表達(dá)，降低HeLa細(xì)胞增殖、侵襲、遷移活性。

綜上所述，miR-375可能通過靶向抑制OTX1表達(dá)，降低宮頸癌增殖、遷移、侵襲活性，可能為臨床治療宮頸癌提供新靶點、新思路。然而癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等惡性生物學(xué)發(fā)生發(fā)展過程中，分子生物學(xué)機(jī)制較為復(fù)雜，miR-375靶向調(diào)控OTX1表達(dá)，抑制宮頸癌增殖、侵襲、遷徙過程的具體分子機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。