林楚曼，方俊博，向倩如，周 蕊，楊 力

1南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東廣州 510280；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510515；3南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東 廣州510515

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是目前世界上最常見的慢性肝病，并且與世界范圍內(nèi)肥胖人數(shù)的增加息息相關(guān)。目前全球NAFLD的患病率約為24%，但是由于檢測手段的局限性，其患病率常常被低估［1,2］。NAFLD與多種代謝性疾病密切相關(guān)，包括肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和血脂異常等［3,4］。然而，目前除了對生活方式的干預(yù)以及減肥之外，尚無明確有效的藥物治療方法［5］。已有研究證明，胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體在人肝細(xì)胞中表達(dá)，提示GLP-1可以直接作用于肝細(xì)胞上的GLP-1R 進(jìn)而發(fā)揮其功能；也有文獻(xiàn)報(bào)道，在NAFLD中，GLP-1R的表達(dá)下調(diào)，提示針對GLP-1R的治療可能有效，因此，我們對GLP-1在NAFLD模型中的作用進(jìn)行了研究。以期為NAFLD的治療提供新的思路

GLP-1是一種由腸道L-細(xì)胞分泌的內(nèi)分泌激素［6］。它在哺乳動物中具有多種功能，包括促進(jìn)胰島素分泌，抑制胰高血糖素的釋放，減緩胃排空，最大限度地減少胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取［7］。GLP-1受體激動劑艾塞那肽（Exendin-4）作為一類新型的抗糖尿病藥物，已在臨床上用于治療2型糖尿病。最近的研究表明GLP-1受體（GLP-1R）在人肝細(xì)胞上表達(dá)，提示GLP-1可以直接作用于肝細(xì)胞上的GLP-1R進(jìn)而發(fā)揮其功能［8］。此外，越來越多的證據(jù)表明，它們能有效降低脂質(zhì)負(fù)荷和游離脂肪酸（FFA）誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡［8-10］。然而，GLP-1改善肝細(xì)胞脂肪變性的確切機(jī)制和所涉及的信號通路尚不完全清楚。我們前期的研究證明，在腎臟中，GLP-1通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR通路激活自噬改善糖尿病腎?。?1］，因此，我們猜想：在NAFLD中，GLP-1發(fā)揮了相似的作用，以改善NAFLD。

自噬是一種細(xì)胞自身產(chǎn)生的應(yīng)激適應(yīng)性反應(yīng)應(yīng)答，其能夠通過降解細(xì)胞毒性蛋白和細(xì)胞器，重新利用細(xì)胞內(nèi)能量資源以應(yīng)對營養(yǎng)物質(zhì)耗竭［12］。自噬功能失調(diào)與多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，包括NAFLD［13］，糖尿病腎病［14］，癌癥［15］和神經(jīng)退行性疾?。?6］等。已有研究表明，GLP-1受體激動劑Exendin-4可通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/Unc-51-樣激酶1（mTOR/ULK1）依賴性自噬減輕葡萄糖毒性引起的心臟損傷［17］；Exendin-4還通過增加自噬流和恢復(fù)溶酶體功能而保護(hù)胰腺β細(xì)胞免于死亡［18］；另外，Exendin-4還通過促進(jìn)大鼠脊髓損傷后的自噬和抑制神經(jīng)元凋亡而促進(jìn)運(yùn)動功能的恢復(fù)［19］。

有研究證明，Exendin-4可通過增強(qiáng)線粒體自噬，減輕氧化應(yīng)激損傷，具有肝臟保護(hù)作用，但未在細(xì)胞水平上探索具體機(jī)制［20］。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制NAFLD 細(xì)胞模型，觀察GLP-1受體激動劑Exendin-4對NAFLD 細(xì)胞模型的作用，并闡明了其可能的潛在機(jī)制，為改善NAFLD的臨床實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人正常肝細(xì)胞LO2和肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。胎牛血清和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（Gibco）。CCK8（cell counting kit-8）試劑盒（全式金生物）。棕櫚酸鈉（PA，sigma）。Exendin-4、3BDO（mTOR激活劑）（MedChemExpress）。油紅O試劑盒（索萊寶）。GLP-1R抗體（博奧森生物），AKT、p-AKT、mTOR、P-mTOR、p62、LC3-I/II、GAPDH 抗體（CST）。Alexa Fluor594標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（賽默飛世爾科技）。4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及肝細(xì)胞脂肪變性模型建立 LO2及HepG2 細(xì)胞均在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在終濃度為0.3 μmol/L的棕櫚酸鈉（PA）作用下，誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性。細(xì)胞分組：（1）正常對照組：使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，無其他任何處理；（2）PA組：0.3 μmol PA，處理24 h；（3）PA+Exendin-4組：PA（0.3 μmol）、Exendin-4（100 nmol）共同處理24 h。按照油紅O試劑盒進(jìn)行脂質(zhì)染色。

1.2.2 CCK-8試驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 將LO2及HepG2兩種細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞后計(jì)數(shù)，按照每組檢測6次，每次5個復(fù)孔，每孔初始1000個細(xì)胞計(jì)算各組的總加細(xì)胞液量，加至96孔板中。分別按照上述分組處理，并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0、1、2、3、4、5 d，向?qū)?yīng)孔加100 μL的CCK8試劑（原液：DMEM培養(yǎng)基=1∶9），立即放回孵箱，避光，反應(yīng)2 h。結(jié)束后，酶標(biāo)儀檢測每孔中液體的吸光度（A450nm）。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光 將LO2及HepG2細(xì)胞鋪至共聚焦小皿中，待細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，0.5%Triton處理15 min，PBS洗滌后在室溫下用5%山羊血清孵育1h以阻斷抗體的非特異性結(jié)合，隨后在4 ℃下與GLP-1R抗體孵育過夜。第2天用PBS 洗滌后，使用Alexa Fluor594 標(biāo)記山羊抗兔IgG熒光二抗避光孵育1 h，最后用DAPI 對細(xì)胞核進(jìn)行染色。用激光共聚焦顯微鏡捕獲圖像。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，加入上樣緩沖液，99 ℃下變性5 min，取等量蛋白進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（90 V，30 min；120 V，60 min）分離蛋白，濕法（200 mA，60 min）轉(zhuǎn)印至PVDF膜；用含5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液室溫封閉1 h；一抗GLP-1R、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p62、LC3-I/II、GAPDH，分別置于4 ℃孵育過夜；PBST液洗膜3次，10 min/洗；二抗羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG分別室溫孵育1 h；PBST液洗膜5次，5 min/洗；ECL發(fā)光試劑盒顯影；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS26統(tǒng)計(jì)軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Exendin-4減少肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積

與NC組相比，PA處理組細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多，而Exendin-4可部分逆轉(zhuǎn)PA的作用，減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積（圖1）。

圖1 Exendin-4緩解肝正常細(xì)胞LO2和肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積Fig.1 Exendin-4 relieves lipid deposition both in normal liver cell line LO2 and hepatoma cell line HepG2.

2.2 Exendin-4促進(jìn)脂質(zhì)沉積細(xì)胞增殖

PA 處理后，細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制，而Exendin-4的加入可逆轉(zhuǎn)PA對細(xì)胞的抑制作用（圖2）。

圖2 Exendin-4促進(jìn)肝正常細(xì)胞LO2和肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞增殖Fig.2 Exendin-4 promotes proliferation of both LO2 and HepG2 cells (Mean±SD).**P＜0.001,***P＜0.001 vs the NC group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs the PAgroup.

2.3 GLP-1R表達(dá)于LO2及HepG2

Western blot結(jié)果顯示，在人正常肝細(xì)胞LO2及肝癌細(xì)胞HepG2中均存在GLP-1R的表達(dá)（圖3）。

圖3 肝正常細(xì)胞LO2和肝癌細(xì)胞HepG2中均有GLP-1受體表達(dá)Fig.3 GLP-1 receptor is expressed in both LO2 and HepG2 cells.

2.4 Exendin-4通過AKT-mTOR信號通路促進(jìn)自噬

Exendin-4處理后，p-mTOR的表達(dá)較PA組下調(diào)，p-AKT的表達(dá)較PA組上調(diào)。WB檢測p62及LC3-I/II的表達(dá)，結(jié)果顯示，Exendin-4可下調(diào)p62，上調(diào)LC3-II的表達(dá)（圖4）。

圖4 Exendin-4通過AKT-mTOR信號通路促進(jìn)肝正常細(xì)胞LO2和肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞自噬Fig.4 Exendin-4 promotes autophagy of LO2 and HepG2 cells viaAKT-mTOR signaling pathway.

2.5 mTOR 激活劑3BDO 逆轉(zhuǎn)Exendin-4 的自噬促進(jìn)作用

在PA誘導(dǎo)的LO2和HepG2細(xì)胞中，給予100 nmol/L Exendin-4處理的同時給予mTOR激活劑Exendin-4可下調(diào)p62，上調(diào)LC3-II的表達(dá)。而在Exendin-4基礎(chǔ)上給予3BDO干預(yù)其p62表達(dá)量上調(diào)，LC3-II表達(dá)量下調(diào)（圖5）。

圖5 mTOR激活劑3BDO能夠逆轉(zhuǎn)Exendin-4的自噬促進(jìn)作用Fig.5 mTOR agonist 3BDO can reverse the autophagypromoting effect of exendin-4.

3 討論

NAFLD是全世界常見的肝臟疾病，其中包括非酒精性脂肪肝與非酒精性脂肪性肝炎。脂肪肝可能不會嚴(yán)重干擾肝功能，但是，脂肪性肝炎合并炎癥和纖維化可發(fā)展為肝損害，并伴有許多并發(fā)癥［21］。高達(dá)80%的肥胖者患有NAFLD，而20%的正常體質(zhì)量的人也有患上這種疾病的風(fēng)險［1］。在中國，約有50%～70%的2型糖尿病患者，他們也更容易患NAFLD。不幸的是，目前還沒有完全證實(shí)的治療NAFLD的藥物，肝移植是治療終末期NAFLD的唯一選擇。因此，臨床上迫切需要一種新的治療NAFLD的新策略。已有研究報(bào)道，GLP-1R表達(dá)于人或小鼠的多種組織細(xì)胞中，如腦［22］、肝［23］、腎［24］、心臟［25］等，也有報(bào)道該受體在NAFLD中表達(dá)下調(diào)［26］，因此我們有理由認(rèn)為，針對該受體的藥物可能成為臨床上治療NAFLD的新靶點(diǎn)。在我們的研究中，通過Western blot檢測到LO2及HepG2兩種細(xì)胞中均存在GLP-1R，免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明GLP-1R主要定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，證實(shí)了給GLP-1R在肝細(xì)胞中的表達(dá)，提示了針對該靶點(diǎn)治療的可行性。在本研究中，由PA誘導(dǎo)的LO2和HepG2的NAFLD細(xì)胞模型中，經(jīng)Exendin-4處理后，油紅O實(shí)驗(yàn)提示PA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積得到部分逆轉(zhuǎn)，并且NAFLD模型細(xì)胞的增殖能力得到促進(jìn)，表明其在GLP-1介導(dǎo)的脂肪肝緩解中的作用。提示GLP-1R激動劑藥物，如新型的抗糖尿病藥物艾塞那肽等，對NAFLD的治療可能有效。意義更為重大的是，本實(shí)驗(yàn)同時也為糖尿病患者合并NAFLD的治療、糖尿病患者的NAFLD預(yù)防提供了新的臨床實(shí)踐指南。然而，GLP-1R介導(dǎo)脂肪肝緩解的胞內(nèi)機(jī)制尚不清楚，亟待進(jìn)一步闡明。

Akt/mTOR是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期和凋亡的重要的信號通路［27］。AKT也稱為蛋白激酶B（PKB），是該信號通路的中心節(jié)點(diǎn)。由于Akt/mTOR通路可能參與上述幾個重要過程，Exendin-4可能通過AKT/mTOR信號通路發(fā)揮作用。自噬依賴自噬體的形成，自噬體具有雙膜結(jié)構(gòu)，隨后可以與溶酶體結(jié)合形成自溶體，是一種自我消化的過程，也被認(rèn)為是消除受損細(xì)胞器和生物大分子以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要過程［28］，但是自噬對經(jīng)Exendin-4處理的NAFLD模型的增殖的影響尚不清楚。AKT/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已被證實(shí)與自噬有關(guān)［29］，但該通路是否參與GLP-1R介導(dǎo)的自噬過程尚不清楚。因此，我們通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證Exendin-4能否通過GLP-1R激活A(yù)KT，抑制mTOR信號通路，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞自噬以減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，本課題利用Western blot檢測Exendin-4處理后的NAFLD細(xì)胞中AKT、mTOR、p62及LC3-I/II蛋白表達(dá)及激活情況。我們發(fā)現(xiàn)，p-AKT 在Exendin-4 處理后表達(dá)上調(diào)而pmTOR 表達(dá)下調(diào)，Exendin-4 在兩種細(xì)胞中均可增加LC3-Ⅱ的表達(dá)，而mTOR激活劑3BDO能夠逆轉(zhuǎn)這一作用，而Exendin-4使PA處理的LO2中p62表達(dá)上調(diào)，HepG2中表達(dá)下調(diào)，而3BDO均能夠上調(diào)p62的表達(dá)。近來，人們愈發(fā)認(rèn)識到，p62與自噬過程密切相關(guān)。p62通過泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域與泛素化蛋白結(jié)合，并將其遞送至自噬體進(jìn)行降解，因此，p62的細(xì)胞水平被認(rèn)為是自噬通量的標(biāo)志［30］。LC3是一種存在于胞質(zhì)的泛素樣蛋白［31］，在發(fā)生自噬時會與自噬小體膜上的磷酸酰乙醇胺共價結(jié)合［32］，因此其被認(rèn)為是自噬小體的標(biāo)志［31］，自噬過程中，脂質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致可溶形式的LC3（LC3-I）轉(zhuǎn)化為LC3自噬囊泡相關(guān)形式（LC3-II）［33］，因此LC3I/II常被用來衡量細(xì)胞自噬水平。然而p62與LC3在GLP-1R介導(dǎo)的改善NAFLD脂質(zhì)沉積中是否發(fā)揮作用尚不清楚。在我們的研究中，證實(shí)了GLP1受體被激活后，胞內(nèi)相關(guān)自噬標(biāo)記分子表達(dá)水平發(fā)生了前述變化，促進(jìn)了細(xì)胞自噬。雖然PA+Exendin-4組中LO2與HepG2的p62水平變化不一致，但是LC3-II的表達(dá)變化一致仍能夠說明細(xì)胞自噬水平升高，因此后續(xù)仍需要對p62進(jìn)行更為深入的研究，如對可溶性與不可溶性的p62區(qū)分檢測，以進(jìn)一步明確Exendin-4對細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用。綜上所述，我們的研究進(jìn)一步證實(shí)Exendin-4作用于GLP-1R并通過AKT-mTOR信號通路，激活細(xì)胞自噬。

Exendin-4 改善肝疾病的機(jī)制已有許多研究，如Exendin-4通過抑制單核/巨噬細(xì)胞社區(qū)人氧化低密度脂蛋白進(jìn)而降低肝臟的炎癥反應(yīng)［34］、或通過降低肝細(xì)胞的氧化水平以改善脂肪變性［35］、而在缺血再灌注損傷引起的肝細(xì)胞脂肪變性中，Exendin-4卻可以通過降低細(xì)胞自噬水平改善脂肪變性［36］。我們的另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)GLP-1能夠通過GLP-1R-PKA-AMPK途徑上調(diào)PPARα，進(jìn)而緩解肝脂肪變性和肝損傷，這些都是Exendin-4治療NAFLD的可能機(jī)制。因此我們認(rèn)為，在NAFLD中，GLP-1發(fā)揮的作用亟待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，GLP-1R激動劑Exendin-4可能通過直接作用于細(xì)胞上GLP-1R，激活A(yù)KT-mTOR信號通路進(jìn)而促進(jìn)自噬，減少NAFLD細(xì)胞模型脂質(zhì)沉積，并促進(jìn)細(xì)胞增殖，提示臨床上使用Exendin-4藥物，艾塞那肽等對NAFLD的治療有效。