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        半乳糖凝集素-3通過lncARSR影響小鼠冠狀動脈粥樣硬化易損斑塊穩(wěn)定的機(jī)制

        2021-07-22 11:30:10許名東李麗華李晚泉劉家超李小丹葉浩彬陳健芳鄒文畢
        關(guān)鍵詞:高脂熒光素酶切片

        許名東,李麗華,李晚泉,劉家超,李小丹,葉浩彬,陳健芳,鄒文畢

        廣東醫(yī)科大學(xué)附屬三水醫(yī)院,廣東 佛山528100

        冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生與包含膽固醇的脂蛋白特別是低密度脂蛋白密切相關(guān)[1]。氧化的低密度脂蛋白充當(dāng)壞死脂質(zhì)的底物,并已被強(qiáng)調(diào)為冠狀動脈粥樣硬化的關(guān)鍵增強(qiáng)劑[2]。炎癥,免疫系統(tǒng)和巨噬細(xì)胞與冠狀動脈疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[3]。炎癥反應(yīng)的收集已被確定為促進(jìn)冠狀動脈疾病患者室性和室上性心律失常的發(fā)生和持續(xù)的因素[4]。Gal-3是一種30000的β-半乳糖,高度保守,廣泛分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外[5]。Gal-3是參與血管內(nèi)炎癥,脂質(zhì)內(nèi)吞,巨噬細(xì)胞活化,細(xì)胞增殖,單核細(xì)胞趨化性和細(xì)胞粘附過程的新型炎癥因子[6]。lncRNA通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)生物過程,包括在轉(zhuǎn)錄水平上動員轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子或染色質(zhì)修飾復(fù)合物,在轉(zhuǎn)錄后水平與RNA和蛋白質(zhì)復(fù)合物相互作用或修飾信號蛋白[7,8]。lncARSR是一種新型鑒定的lncRNA,其包含四個(gè)長為591nt 的外顯子,位于9 號染色體上[9]。最近,lncARSR被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)志物,并參與了不同疾病的進(jìn)展[10,11]。已知?jiǎng)用}粥樣硬化和炎癥之間存在相互作用,但Gal-3與lncARSR在動脈粥樣硬化發(fā)展中和斑塊失穩(wěn)中的作用仍存在爭議[12],本文旨在探討Gal-3通過lncARSR影響冠狀動脈粥樣硬化易損斑塊穩(wěn)定的機(jī)制。

        1 材料和方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)及設(shè)施

        采用8周齡SPF級雄性ApoE-/-C57BL/6小鼠,所有小鼠置于層流控制柜中,室溫控制在24~26 ℃,相對濕度為40%~60%,室內(nèi)定期紫外線消毒,籠子,墊料,飲用水和飼料均在高壓下滅菌。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)設(shè)施由廣東醫(yī)科大學(xué)提供。本研究經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)附屬三水醫(yī)院倫理委員會審批(佛科倫理號201901),動物實(shí)驗(yàn)簽訂《201901課題組動物實(shí)驗(yàn)倫理承諾書》。

        1.2 小鼠分組及取材

        將8周齡SPF級雄性ApoE-/-C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3 組:正常飲食組(n=20),高脂飲食組(15%脂肪和0.25%膽固醇飲食,n=20),高脂飲食+lncARSR抑制劑組(15%脂肪和0.25%膽固醇飲食,隔日尾靜脈注射50 nmol/L lncARSR抑制劑,n=20)。其中l(wèi)ncARSR抑制劑為含有l(wèi)ncARSR反義寡鏈核苷酸質(zhì)粒的慢病毒載體[13]。

        實(shí)驗(yàn)12周后,用3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠,固定小鼠四肢,切開胸腹內(nèi)側(cè)皮膚,分離肌肉和皮下組織并暴露心臟和主動脈,用1 mL注射器從心臟中收集血液后,將心臟和主動脈取出,沿垂直軸解剖主動脈,隨后從心臟到主動脈根部取2~3 cm樣本,置于10%中性福爾馬林緩沖液中固定并切片,離心后的血清和血漿保存在-20 ℃。

        1.3 蘇丹IV染色和油紅O染色

        為了量化主動脈弓中的冠狀動脈粥樣硬化病變情況,對已固定的主動脈弓進(jìn)行蘇丹IV染色,并測量蘇丹IV陽性面積的百分比。

        沿左心房和右心房下端之間的水平面切開每個(gè)心臟。上部以最佳切割溫度的化合物(TECK)速凍。從主動脈瓣出現(xiàn)點(diǎn)到升主動脈連續(xù)切片(厚度為5 μm),直到不再可見瓣膜尖為止。冠狀動脈粥樣硬化斑塊中的脂質(zhì)含量通過油紅O染色確定。

        1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

        用0.25%胰蛋白酶和膠原酶的混合物消化冠狀動脈組織,分散到單細(xì)胞懸液中,在補(bǔ)充10%胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(上述試劑均為Gibco)中,在5%CO2恒溫箱中于37 ℃加熱培養(yǎng)。

        為了進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將第3~5代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),分為3組:對照轉(zhuǎn)染組(冠狀動脈細(xì)胞空白轉(zhuǎn)染);Gal-3轉(zhuǎn)染組(冠狀動脈細(xì)胞Gal-3模擬物轉(zhuǎn)染,Gal-3過表達(dá));Gal-3抑制組(冠狀動脈細(xì)胞Gal-3抑制劑轉(zhuǎn)染,Gal-3抑制表達(dá))。使用Lipofectamine 3000(60 μmol/L)oligo Gal-3模擬物,60 μmol/L Gal-3抑制劑或60 μmol/L寡核苷酸陰性對照劑轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中(Invitrogen)。Gal-3模擬物,抑制劑和陰性對照劑參照文獻(xiàn)[14,15]設(shè)計(jì),由廣州市銳博生物科技有限公司合成。

        1.5 蛋白質(zhì)印跡法

        取大鼠左冠狀動脈,利用與蛋白酶抑制劑混合物混合的RIPA 試劑(碧云天)裂解細(xì)胞。通過10%SDSPAGE凝膠電泳分離總蛋白,并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將膜用含5%脫脂牛奶的Tris緩沖鹽水(碧云天)封閉1 h,并與一抗Gal-3(1∶1000,細(xì)胞信號技術(shù)公司)、ARSR(1∶1000,艾博抗)在4 ℃下孵育過夜。使用Quantum One軟件(伯樂)通過光密度法分析放射自顯影圖,與GAPDH(1∶1000,美國細(xì)胞信號技術(shù)公司)作為對照。

        1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因測定

        分別構(gòu)建了靶基因lncARSR的雙熒光素酶報(bào)告基因載體和在野生型(WT)-lncARSR 和mut-lncARSR。將上述兩個(gè)載體與Gal-3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到冠狀動脈細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后,按照TransDetect雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(FR201-01,北京全式金生物公司),裂解細(xì)胞并收集上清液。熒光素酶活性使用Dual-Luciferase?Reporter Assay System(E1910,Promega)檢測。將預(yù)先平衡至室溫的100 μL熒光素酶反應(yīng)試劑添加到試管中,并與20 μL細(xì)胞裂解液混合。在檢測到螢火蟲熒光素酶后,通過添加100 μL熒光素酶反應(yīng)試劑II來檢測熒光素酶,該試劑也要平衡至室溫。螢火蟲熒光素酶與熒光素酶的比例(FL/RL)被視為相對熒光素酶活性。

        1.7 免疫組織化學(xué)

        將冷凍的切片從-20 ℃的冰箱中取出,在室溫下加熱,固定在冰丙酮中。將丙酮風(fēng)干,切片置于抗原回收箱中,用PBS沖洗3次,并置于臺式濃縮儀上。在室溫下將切片用0.3%的tritonX-100浸沒以使細(xì)胞膜破裂。將周圍的水滴干燥后,用5%BSA密封切片。將切片與稀釋的第一抗體PI3K(1∶5000,艾博抗)和Akt(1∶1000,艾博抗)在濕度箱中于4 ℃孵育過夜。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶1000,艾博抗),將切片孵育30 min。后用蘇木精使細(xì)胞核重新染色1 min,進(jìn)行乙醇脫水,二甲苯透化和香脂安裝。褐色顆粒被認(rèn)為是靶蛋白陽性表達(dá)的代表,隨機(jī)選擇五個(gè)切片進(jìn)行測量。

        1.8 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)

        取得轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,使用Trizol試劑(15596-018,北京太陽生物生命科學(xué)有限公司)提取細(xì)胞和組織的總RNA以及外來體RNA,測量RNA濃度。實(shí)驗(yàn)中使用的引物由Takara合成(表1)。根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算目標(biāo)基因的相對轉(zhuǎn)錄水平:ΔΔCT=ΔC實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對照組,ΔCt=CT(目標(biāo)基因)-CT(內(nèi)部參照)。

        表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Sequence of primers of RT-PCR

        1.9 統(tǒng)計(jì)分析

        本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件(IBM)進(jìn)行處理;計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析或者重復(fù)測量的方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用百分率(%)表示,組間比較采用χ2分析;P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 小鼠冠狀動脈粥樣硬化和斑塊特征分析

        高脂飲食組較正常飲食組中蘇丹IV陽性面積和紅油染色面積升高,高脂飲食+lncARSR抑制劑組較高脂飲食組蘇丹IV 陽性面積和紅油染色面積降低(P=0.007,0.014,圖1,表2)。

        表2 蘇丹IV和油紅染色Tab.2 Quantitative analysis of coronary atherosclerosis and plaque in mice(Mean±SD)

        圖1 小鼠冠狀動脈粥樣硬化和斑塊特征分析Fig.1 Analysis of coronary atherosclerosis and plaques in mice.A:Sudan IV staining;B:Oil red O staining(Original magnification:×40).

        2.2 Western blot分析Gal-3和ARSR的蛋白表達(dá)量

        高脂飲食組較正常飲食組Gal-3和ARSR的蛋白表達(dá)升高。高脂飲食+lncARSR抑制劑組較高脂飲食組Gal-3 和ARSR 的蛋白表達(dá)降低(P=0.015,0.007,圖2,表3)。

        表3 Gal-3和ARSR的蛋白表達(dá)Tab.3 Analysis of protein expression of Gal-3 and ARSR with Western blotting(Mean±SD)

        圖2 Western blot分析Gal-3和ARSR的蛋白表達(dá)量Fig.2 Analysis of protein expression of Gal-3 andARSR with western blotting.

        2.3 雙熒光素酶活性

        Gal-3轉(zhuǎn)染組較對照轉(zhuǎn)染組、Gal-3抑制組的WTlncARSR酶活性升高,Gal-3抑制組較對照轉(zhuǎn)染組WTlncARSR 酶活性降低(P=0.026,P=0.017),而在mutlncARSR的酶活性檢測中,對照轉(zhuǎn)染組、Gal-3轉(zhuǎn)染組和Gal-3抑制組中mut-lncARSR的酶活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表4)。

        表4 熒光素酶活性Tab.4 Luciferase activity(Mean±SD)

        2.4 免疫組化分析PI3K和Akt的表達(dá)

        高脂飲食組較正常飲食組PI3K和Akt的蛋白表達(dá)升高,高脂飲食+lncARSR 抑制劑組較高脂飲食組PI3K和Akt的蛋白表達(dá)降低(P=0.023,P=0.007,表5)。

        表5 免疫組化分析PI3K和Akt的表達(dá)Tab.5 Analysis of the expression of PI3K and Akt with immunohistochemistry(Mean±SD)

        2.5 RT-PCR分析TNF-α、IL-β、IL-6的mRNA表達(dá)

        高脂飲食組較正常飲食組TNF-α、IL-β、IL-6 的mRNA表達(dá)升高,高脂飲食+lncARSR抑制劑組較高脂飲食組TNF-α(P=0.012)、IL-β(P=0.035)、IL-6(P=0.017)的mRNA表達(dá)降低(表6)。

        表6 促炎因子的mRNA表達(dá)分析Tab.6 Expression of proinflammatory factor mRNA(Mean±SD)

        3 討論

        冠狀動脈粥樣硬化被認(rèn)為是復(fù)雜的炎癥過程,涉及多種炎癥標(biāo)志物。作為重要的炎癥生物標(biāo)志物,Gal-3可通過劑量依賴性激活巨噬細(xì)胞來促進(jìn)其他促炎因子的分泌,例如TNF-α和IL-6[16-18]。Gal-3還參與脂質(zhì)內(nèi)吞,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞分化,細(xì)胞粘附和腫瘤轉(zhuǎn)移的進(jìn)展。已證明Gal-3的水平在人的冠狀動脈粥樣硬化斑塊和某些動物模型中發(fā)展,尤其是高膽固醇血癥的兔子和帶有血管狹窄的載脂蛋白E敲除(ApoE-/-)小鼠[19]。一項(xiàng)研究比較了高脂飲食與野生型對照之間的ApoE-/-小鼠主動脈組織的Gal-3水平,發(fā)現(xiàn)ApoE-/-小鼠的Gal-3 mRNA和蛋白水平分別升高了16.3和12.2倍分別比野生型。而且,與同一位患者的穩(wěn)定區(qū)域相比,在mRNA和蛋白質(zhì)水平上,Gal-3在不穩(wěn)定斑塊中的表達(dá)都增加了,經(jīng)Gal-3處理的人類巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)了人類單核細(xì)胞趨化性提高了11倍[20]。本研究中高脂飲食組較正常飲食組TNF-α、IL-β、IL-6 的mRNA 表達(dá)升高,高脂飲食+lncARSR抑制劑組較高脂飲食組TNF-α、IL-β、IL-6的mRNA 表達(dá)降低,表明高脂飲食引起的小鼠冠狀動脈粥樣硬化模型中Gal-3和ARSR的表達(dá)升高。這也證明Gal-3和lncARSR可能是頸動脈斑塊易損性的標(biāo)志[21-23]。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因測定Gal-3與lncARSR的靶標(biāo)關(guān)系,確定了Gal-3與lncARSR存在靶向關(guān)系,這與之前的研究結(jié)果一致[24-26]。本研究還證實(shí),當(dāng)Gal-3與lncARSR之間的靶向作用被抑制后,小鼠的冠狀動脈粥樣硬化也受到了抑制,Gal-3和ARSR的蛋白表達(dá)降低(P=0.015,0.007)。

        PI3K信號傳導(dǎo)是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖,存活和死亡的多種細(xì)胞表面受體的下游。受體酪氨酸激酶和生長因子的激活誘導(dǎo)PI3K活性,形成Ia類脂質(zhì)激酶異二聚體,后者由催化和調(diào)節(jié)亞基組成。PI3K/Akt信號通路具有多種細(xì)胞功能,包括增殖,分化,存活和侵襲,lncRNA密切相關(guān)[27-29]。研究表明,通過激活巨噬細(xì)胞自噬,選擇性抑制PI3K/Akt通路可抑制冠狀動脈粥樣硬化的進(jìn)展并增強(qiáng)冠狀動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性[10,11,30]。我們的結(jié)果顯示,PI3K/Akt通路在冠狀動脈粥樣硬化中激活表達(dá),lncARSR抑制劑調(diào)控PI3K/Akt信號通路,調(diào)節(jié)冠狀動脈粥樣硬化易損斑塊穩(wěn)定,PI3K和Akt的蛋白表達(dá)降低(P=0.023,0.007)。

        綜上所述,冠狀動脈粥樣硬化中Gal-3和ARSR過量表達(dá)。Gal-3能靶向lncARSR,通過抑制lncARSR表達(dá),調(diào)控PI3K/Akt信號通路,降低炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)冠狀動脈粥樣硬化易損斑塊穩(wěn)定。

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