王文忠，周蘭柱，孫 哲，吳 俊，崔憶旋

蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，安徽 蚌埠233000

鼻咽癌（NPC）是一種上皮細胞的惡性腫瘤［1］，中國是世界鼻咽癌發(fā)病率和死亡率水平較高的國家之一，我國鼻咽癌的死亡率占全國惡性腫瘤死亡率的2.81%，發(fā)病率占世界的80%以上。NPC其他類型的頭頸癌不同，因為NPC細胞在腫瘤發(fā)展的早期階段可能轉移至淋巴結或侵襲周圍組織［2］。這是主要原因對于NPC的預后不良，因為它很難在早期發(fā)現(xiàn)，并且有75%的患者在診斷時出現(xiàn)晚期［3］。盡管為減少與NPC相關的死亡人數(shù)做出了巨大努力，但在轉移患者中，其5年生存率仍然僅為50%～60%［4,5］。雖然為闡明NPC侵襲和轉移的潛在機制進行了許多研究，仍需要研究新的靶點以制定有效的治療策略。

TRIM59是三結構域蛋白（TRIM）家族的新成員，在細胞生長、分化、發(fā)育、凋亡、抗病毒、炎癥和免疫等方面發(fā)揮重要的作用［6-12］，據(jù)報道TRIM59在肝癌、胃癌、前列腺癌等腫瘤中表達顯著升高，且與腫瘤臨床分期及預后緊密相關［13-15］。目前，尚無研究報道NPC中TRIM59的功能。蛋白磷酸酶1B(PPM1B)是金屬依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶家族的成員，參與多種信號轉導途徑的調控，與同類其他的信號轉導酶共同來調節(jié)癌細胞的基本生命活動［16］，已有文獻表明，TRIM59通過調節(jié)PPM1B信號通路促進肝癌細胞生長，TRIM59能否靶向PPM1B影響鼻咽癌細胞侵襲和遷移尚未有研究，本實驗擬通過檢測鼻咽癌組織和細胞水平TRIM59的表達差異，判斷其在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用，進一步探討TRIM59靶向調控PPM1B對鼻咽癌侵襲和轉移的影響，這對于探索鼻咽癌治療新靶點和有著重要意義，本課題將對此提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人正常鼻黏膜上皮細胞系（HNEpC）和人鼻咽癌細胞6-10B、CNE-2、HNE1均購自上海細胞庫。

1.1.2 藥品與試劑 TRIM59 抑制物（si-TRIM59）、TRIM59 模擬物（mimic-TRIM59）、PPM1B 模擬物（mimic-PPM1B）以及Lipofectamin2000（上海吉瑪基因）；RNA 提取試劑盒，逆轉錄試劑盒，熒光定量PCR試劑盒，引物(賽默飛）；雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)及報告載體（Promega）；Mateigel基質（上海前塵生物科技）；TRIM59，PPM1B，β-actin及兔/鼠二抗（上海艾博抗）。

1.2 方法

1.2.1 標本來源 蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院收集癌旁組織及鼻咽癌組織10例，所有患者術前均未接受過靶向、放化療或內分泌等輔助治療，所有患者均簽署知情同意書，實驗方案由蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 人正常鼻黏膜上皮細胞系（HNEpC）和人鼻咽癌細胞6-10B、CNE-2、HNE1培養(yǎng)在含100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2飽和濕度的細胞恒溫培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。

1.2.3 細胞轉染分組 取HNE1細胞株接種于六孔板，待細胞融合度為整個六孔板的60%嚴格按照說明書對HNE1細胞中TRIM59進行下調，實驗按照如下分組：Control組（Lip2000處理HNE1細胞）、NC組（Lip2000+inhibitor NC序列轉染HNE1細胞）、si-TRIM59 組（Lip2000+inhibitor TRIM59 轉染HNE1 細胞）；對HNE1細胞中TRIM59進行上調，實驗按照如下分組：Control組（Lip2000處理HNE1細胞）、NC組（Lip2000+mimic-NC 序列轉染HNE1 細胞）、mimic-TRIM59 組（Lip2000+mimic-TRIM59轉染HNE1細胞），對已下調TRIM59 的HNE1 細胞（si-TRIM59 組）同時上調PPM1B，實驗按照如下分組：Control組（si-TRIM59組）、NC 組（Lip2000+NC 序列轉染si-TRIM59 組細胞）、si-TRIM59 組+mimic-PPM1B 共轉染組（Lip2000+mimic-PPM1B序列轉染si-TRIM59組細胞），在37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中轉染8 h，換成10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 總RNA提取及實時熒光定量PCR檢測mRNA的相對表達量 使用TRizol 試劑從HNEpC、6-10B、HNE1、CNE-2細胞中提取總RNA，使用cDNA反轉錄試劑盒合成互補DNA模板；進行實時定量PCR以檢測細胞中mRNA的表達水平。引物序列如下：U6用作內參對照，TRIM59 上游引物TGACTGACACACACT GGACA下游引物CTGCTGCTCTCGTATTTCCT；PPM1B 上游引物GACTGAATCCACATAGAGAAA；下游引物GCACCCAAAGTATCGCCAGAA。RT-PCR條件：95 ℃持續(xù)3 min，94 ℃持續(xù)15 s，60 ℃持續(xù)55 s，72 ℃持續(xù)30 s，進行35 個循環(huán)，通過2-ΔΔCt方法計算mRNA相對表達量，實驗重復3次。

1.2.5 雙熒光素酶報告實驗 取對數(shù)生長期的HNE1細胞接種于6孔板中，實驗分為PPM1B-WT+陰性對照組（NC-WT）、PPM1B-WT+TRIM59 抑制劑組（PPM1BWT）、PPM1B-Mut+陰性對照組（NC-Mut）、PPM1BMut+TRIM59抑制劑組（PPM1B-Mut），將構建成功的pGL3-PPM1B-3'UTR-Wt和pGL3-PPM1B-3'UTR-Mut質粒轉染至HNE1細胞，轉染24 h后應用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒檢測HNE1的熒光強度，具體操作按試劑盒說明書要求進行。分析檢測結果：A活性倍數(shù)=（R/F）樣品/（R/F）對照，螢火蟲熒光素酶用F表示，海腎熒光素酶用R表示。最后以螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶熒光活性的相對活性比值作為報告基因活性值（海腎熒光素酶熒光值作為內參）。

1.2.6 Transwell 檢測細胞侵襲遷移能力 侵襲實驗：細胞分組同1.2.3，每孔鋪60 μL基質膠，置于37 ℃培養(yǎng)箱中凝固1 h，取處于對數(shù)生長期的各組HNE1細胞，每組設3個復孔，使用無血清培養(yǎng)基重懸于上室中，下室加入600 μL 含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)24 h；取出小室；小心吸去上室中培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定15 min，結晶紫染色10 min；PBS漂去多余染料，使用電子顯微鏡隨機選取5個視野細胞進行計數(shù)。遷移實驗：細胞分組同1.2.3，除無需鋪基質膠外步驟同侵襲實驗，實驗重復3次。

1.2.7 Western blot法檢測蛋白相對表達量 將取下的鼻咽癌和癌旁組織在液氮中冷凍保存，取100 mg組織樣本剪碎，加入組織蛋白提取液，用組織勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體。將組織勻漿吸入預冷的干凈離心管中，在4 ℃，10 000 r/min條件下離心5 min，將上清吸入另一預冷的干凈離心管，即可得到組織總蛋白，將上述蛋白提取物定量。后分裝于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌嶒灒瑫r各組細胞裂解提取后提取蛋白，使用BCA法檢測蛋白質濃度，各組取等量蛋白樣品進行電泳，將蛋白轉移至PVDF 膜，快速封閉液封閉30 min，一抗（TRIM59、PPM1B、β-actin）按1∶1000 稀釋，置于搖床上4 ℃條件下?lián)u晃過夜。TPBS 溶液漂洗3次，二抗1∶5000 稀釋，孵育2 h，TPBS溶液洗3次，曝光顯影，實驗重復3次。

1.2.8 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 21.0軟件計算實驗數(shù)據(jù)，定量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用方差分析。組間兩兩比較使用LSD-t檢驗，P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 數(shù)據(jù)庫中多種腫瘤及鼻咽癌中TRIM59表達情況

通過TCGA 數(shù)據(jù)庫分析鼻咽癌與癌旁組織TRIM59表達水平（圖1），TRIM59在鼻咽癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.006）。

圖1 數(shù)據(jù)庫中TRIM59在鼻咽癌中的表達情況Fig.1 Expression of TRIM59 in nasopharyngeal carcinoma and adjacent tissues based on data from the cancer genome atlas database.**P=0.006.

2.2 鼻咽癌和癌旁組織中TRIM59和PPM1B的相對表達量

Western blot結果表明，與癌旁組織相比，鼻咽癌組織中TRIM59 相對表達量均顯著增加（P=0.01），PPM1B 蛋白相對表達量均顯著降低（圖2A～C），差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.03）。

圖2 鼻咽癌和癌旁組織中TRIM59和PPM1B蛋白相對表達量Fig.2 Expressions of TRIM59 and PPM1B proteins in nasopharyngeal carcinoma and adjacent tissues.A:Western blotting for TRIM59 and PPM1B proteins in nasopharyngeal carcinoma and adjacent tissues.B,C:Gray value of the blots of TRIM59 and PPM1B proteins(n=3,*P＜0.05 vs normal).

2.3 篩選NPC細胞株中TRIM59和PPM1B表達差異最高的細胞株

以人正常鼻黏膜上皮細胞系（HNEpC）作為對照，從鼻咽癌細胞株6-10B、CNE-2、HNE1中篩選出TRIM59和PPM1B表達差異最高的細胞株，TRIM59 mRNA和蛋白在HNE1 中表達均顯著增加（圖3A、C），PPM1B mRNA和蛋白在HNE1中表達均顯著下降（圖3B、C），因此選擇HNE1作為后續(xù)研究細胞株，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.04）。

圖3 TRIM59和PPM1B在不同鼻咽癌組織中表達情況Fig.3 TRIM59 and PPM1B expressions in different nasopharyngeal carcinoma tissues.A,B:Expressions of TRIM59 and PPM1B mRNA in nasopharyngeal carcinoma cells detected using RT-PCR,respectively.C-E:Western blotting for detecting TRIM59 and PPM1B expressions in nasopharyngeal carcinoma cells and quantitative analysis of the results(n=3,*P＜0.05 vs HNEpC cells).

2.4 TRIM59與PPM1B的靶向關系

當下調HNE1細胞中TRIM59表達后PPM1B蛋白的表達顯著增加（圖4A～C），與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.01）。當上調PPM1B表達后TRIM59蛋白的表達無明顯變化（圖4D～F），同時雙熒光素酶報告基因實驗顯示PPM1B-WT（野生型）相對熒光素酶活性較NC-WT組明顯增加，TRIM59能夠有效促進野生型PPM1B熒光素酶活性，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.01），PPM1B-Mut（突變型）組相對熒光素酶活性與NC-Mut組相比無明顯變化（圖4G）。

圖4 TRIM59與PPM1B的靶向關系Fig.4 Targeting relationship between TRIM59 and PPM1B.A-C:Western blotting for TRIM59 and PPM1B protein expression in HNE1 cells with TRIM59 knockdown.D-F:Western blotting TRIM59 and PPM1B protein in HNE1 cells with PPM1B knockdown.G:Dual luciferase reported assay for verification of the targeting relationship between TRIM59 and PPM1B (n=3,*P＜0.05,**P＜0.01 vs control/mimic-NC/inhibitor NC).

2.5 TRIM59對HNE1細胞侵襲和遷移的影響

Transwell結果表明，單獨上調HNE1細胞TRIM59表達后，與對照組相比，細胞侵襲（P=0.01，圖4A、B）和遷移能力均增加（P=0.02，圖5C、D），差異具有統(tǒng)計學意義。單獨下調HNE1細胞TRIM59表達后，與對照組相比，細胞侵襲（P=0.01，圖5E、F）和遷移能力均下降（圖P=0.01，5G、H），差異具有統(tǒng)計學意義。

圖5 下調TRIM59表達對HNE1細胞侵襲和遷移的影響Fig.5 Effect of TRIM59 overexpression and knockdown on invasion and migration of HNE1 cells(n=3).A,B:Effect of TRIM59 overexpression on cell invasion.C,D:Effect of TRIM59 overexpression on cell migration.E,F:Effect of TRIM59 knockdown on cell invasion.G,H:Effect of TRIM59 knockdown on cell migration.*P＜0.05 vs control/mimic-NC/inhibitor NC.

2.6 TRIM59靶向調控PPM1B表達促進HNE1細胞侵襲和遷移

Transwell 結果顯示，同時下調TRIM59 和上調PPM1B 表達，與對照組相比，HNE1侵襲能力較單獨下調TRIM59降低（圖6A、B），差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.02）。同時，HNE1遷移能力較單獨下調TRIM59降低（圖6C、D），差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.01）。

圖6 TRIM59靶向調控PPM1B表達促進HNE1細胞侵襲和遷移Fig.6 TRIM59 promotes HNE1 cell invasion and migration by targeted regulation of PPM1B expression (n=3).A,B:Simultaneous PPM1B overexpression and TRIM59 knockdown inhibits HNE1 cell invasion.C,D:Simultaneous PPM1B overexpression and TRIM59 knockdown inhibits HNE1 cell migration.*P＜0.05 vs control/NC.

3 討論

TRIM家族是進化保守的基因家族，涉及許多生物學過程。例如，TRIM19，TRIM24，TRIM25 和TRIM68與白血病，乳腺癌和前列腺癌有牽連［17］。TRIM59在多種癌細胞中表達增加，如非小細胞肺癌，卵巢癌，胰腺癌，食管癌等［18-21］。TRIM59可以通過多種不同途徑參與不同腫瘤的進程，在胃癌中，TRIM59 介導P53 泛素化降解來促進胃癌的發(fā)生發(fā)展［22］；在前列腺癌中，TRIM59通過激活Ras和Rb信號通路促進腫瘤進展［23］；在肺癌中干擾TRIM59后使細胞周期出現(xiàn)G2期阻滯，調控周期蛋白的表達［24］。TRIM59作為一個潛在的促癌基因被研究，我們猜測其在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中同樣發(fā)揮促癌作用。通過查閱數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)TRIM59在鼻咽癌等大多數(shù)腫瘤組織中表達異常增高，我們研究首次發(fā)現(xiàn)，TRIM59在鼻咽癌組織和鼻咽癌細胞HNE1中高表達，當單獨上調TRIM59表達，HNE1細胞侵襲和遷移率均增加，單獨下調TRIM59表達，HNE1細胞的侵襲和遷移均受到顯著抑制。

PPM1B 是腫瘤抑制物，參與了多種癌癥通路。PPM1B的過表達抑制腫瘤細胞增殖、體內腫瘤生長、遷移和侵襲，而PPM1B的耗竭則顯示出相反的作用［25-27］。PPM1B通過去磷酸化CDK2與CDK6調控細胞周期［28］，同時能夠去磷酸化RIP3 負調控壞死性凋亡過程［29］。PPM1B的過表達會導致腫瘤細胞生長阻滯或壞死，P53和NF-κB是調控細胞內基因表達和生物體衰老的關鍵轉錄因子，PPM1B能夠負調控P53和NF-κB從而減弱細胞衰老的基因表達程序［30］。同時PPM1B可以作為腫瘤的診療指標，能夠通過自身或形成復合體后靶向作用于某些蛋白，使相應的蛋白去磷酸化，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［31］。本研究發(fā)現(xiàn)PPM1B在鼻咽癌中表達降低，為了研究TRIM59抑制鼻咽癌侵襲和遷移是否與PPM1B有關，通過Western blot 和雙熒光素酶實驗均證明PPM1B是TRIM59的靶基因，同時TRIM59能夠負調控PPM1B表達。TRIM59作為一個潛在的癌基因能否調控PPM1B影響鼻咽癌細胞的侵襲遷移？當同時下調TRIM59且上調PPM1B表達后，HNE1細胞侵襲和遷移能力均較單獨下調TRIM59 表達顯著被抑制，說明TRIM59通過靶向PPM1B影響鼻咽癌侵襲和遷移。

綜上所述，通過細胞學實驗證實，抑制HNE1細胞中TRIM59表達能夠抑制細胞的侵襲和遷移，其機制可能與抑制PPM1B有關，這些發(fā)現(xiàn)將為鼻咽癌的診斷和治療提供新的思路。