陳忠軍，張鈺皎，胡煒東，孫子羽，蘇 杰，滿都拉*

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、腸炎沙門(mén)氏菌（Salmonella enterica）和大腸桿菌（Escherichia coli）是主要的食源性病原菌，它們極易在食品加工過(guò)程中形成混合菌生物被膜?；旌暇锉荒な亲匀唤缍喾N微生物為適應(yīng)脅迫環(huán)境，通過(guò)分泌胞外多糖等基質(zhì)而形成的有利于生存的微生物集落?；旌暇锉荒じy以被清除，從而導(dǎo)致食品腐敗等食品安全性問(wèn)題[1-3]。金黃色葡萄球菌是一種常見(jiàn)的人、畜共患病病原菌，不僅會(huì)造成細(xì)菌性食物中毒，還會(huì)對(duì)食品加工人員造成危害[4]。金黃色葡萄球菌的致病性主要與其分泌的多種毒素因子有關(guān)，包括腸毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）、黏附素（Adhesion factors）、溶血素（hemolysin，HL）、殺白細(xì)胞素（Panton-Valentine leucocidin，PVL）、脫皮毒素（Exfoliatives，ETs）、中毒性休克綜合征毒素（toxic shock syndrome toxin，TSST）和凝固酶（Coagulase，CaL）等[5-8]。

本文對(duì)食源性混合病原菌生物被膜（金黃色葡萄球菌-大腸桿菌-沙門(mén)氏菌）進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，以其中優(yōu)勢(shì)菌（金黃色葡萄球菌）為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)其特有的28 種目的毒素基因的定量，計(jì)算單一菌和混合菌生物被膜中金黃色葡萄球菌特有毒素基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，旨在進(jìn)一步分析生物被膜中金黃色葡萄球菌的致病性，并為其有效防治提供依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC 26003-3、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 11775-3、腸炎沙門(mén)氏菌（Salmonella enterica）ATCC 14028，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；結(jié)晶紫、氯化鈉、0.1mol/L PBS、草酸銨、甲醇、冰醋酸，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Trizol試劑，天根生化科技（北京）有限公司；Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus），ROX plus、DL2000 DNA Marker，TaKaRa（寶生物）；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（Tryptone Soy Broth，TSB），北京陸橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TM4000 plus 掃描電鏡，日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)那珂事業(yè)所；Synergy H1 全功能微孔板檢測(cè)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；NANODROP 2000 分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Tanon 1600 凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；ABI7500 熒光定量PCR 儀，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；LDZX 全自動(dòng)高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；GHP 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；QL-902 渦旋振蕩儀，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；Centrifuge 5415D 離心機(jī)，艾本德中國(guó)有限公司。

2 方法

2.1 食源性混合病原菌生物被膜的制備

將大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌活化后稀釋至OD600nm=0.1（約為1.5×108CFU/mL）。經(jīng)無(wú)水乙醇浸泡過(guò)夜的不銹鋼片（0.5 cm×0.5 cm）放入TSB 試管中后滅菌，將3 種稀釋液1∶1∶1 混合后以1%的接種量接種于上述TSB 試管，37 ℃下培養(yǎng)后取出不銹鋼片，無(wú)菌PBS 輕輕漂洗3 次，去除浮游菌[9-10]。

2.2 食源性混合病原菌生物被膜的定性檢測(cè)

2.2.1 銀染法（AgNO3）對(duì)混合菌生物被膜形成能力的檢測(cè) 按照2.1 節(jié)方法，分別培養(yǎng)0.5，1，3，5，7 d 后，將清洗后的透明玻璃片在2.5%戊二醛PBS 溶液中固定1 h；蒸餾水漂洗后用飽和氯化鈣溶液結(jié)合15 min；蒸餾水浸泡清洗15 min；加入5%硝酸銀溶液反應(yīng)15 min；1%對(duì)苯二酚溶液浸泡2 min；蒸餾水漂洗后用5%硫代硫酸鈉溶液固定2 min；蒸餾水漂洗干凈后用普通光學(xué)顯微鏡觀察[11]。

2.2.2 掃描電鏡（SEM）對(duì)混合菌生物被膜形成能力的檢測(cè) 按照2.1 節(jié)方法培養(yǎng)混合菌生物被膜，取出不同培養(yǎng)階段（0.5，1，3，5，7 d）的不銹鋼片，無(wú)菌PBS 漂洗3 次后放入4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛中固定4 h；使用梯度乙醇脫水（50%，60%，70%，80%，90%乙醇中各浸泡10 min，100%無(wú)水乙醇浸泡2 次，15 min/次）；醋酸異戊酯置換2 次，15 min/次；樣品臨界點(diǎn)干燥并噴金后使用掃描電鏡進(jìn)行觀察[12]。

2.3 食源性病原菌生物被膜的定量檢測(cè)

2.3.1 結(jié)晶紫染色法對(duì)混合菌生物被膜量的檢測(cè)將大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌稀釋液1∶1∶1 混合，以1%的接種量接種于裝有200 μL TSB 培養(yǎng)基的96 孔板中，37 ℃分別培養(yǎng)0.5，1，3，5，7 d。將培養(yǎng)液棄去后用300 μL 的無(wú)菌PBS沖洗3 次，60 ℃下干燥1 h，然后于每孔中添加200 μL 無(wú)水甲醇固定15 min，干燥后添加200 μL的2%結(jié)晶紫染液染色20 min，蒸餾水沖洗孔壁至沖洗液無(wú)色，干燥后于每孔中添加300 μL 的33%冰醋酸靜置10 min，微孔板檢測(cè)儀振蕩10 min 后于630 nm 下測(cè)定吸光度值，不接菌TSB 作空白對(duì)照[13]。

相對(duì)OD 值（SI）可反映出生物被膜的形成量。SI=OD/ODC（ODC等于空白孔的平均值加上其3 倍標(biāo)準(zhǔn)差而得到的OD 值）可衡量生物被膜的形成能力：04 為大量生物被膜形成量（+++）[14]。

2.3.2 病原菌生物被膜的活菌數(shù)檢測(cè)

2.3.2.1 單菌生物被膜的活菌數(shù)檢測(cè) 將3 種病原菌的稀釋液分別以1%的接種量接種于裝有不銹鋼片的TSB 試管中，37 ℃下分別培養(yǎng)6，12，24，36，48，72 h 后取出不銹鋼片，無(wú)菌PBS 輕輕漂洗3 次以去除浮游菌。無(wú)菌棉棒刮擦其表面，然后將棉棒和不銹鋼片一起放入盛有4 mL 無(wú)菌PBS 試管中，超聲水浴10 min 并漩渦振蕩后取菌懸液。然后于無(wú)菌PBS 液中做系列10 倍稀釋，選擇1 mL 適宜稀釋度液加入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，并傾注冷卻至45 ℃的TSA 培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)48 h 后菌落計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。

2.3.2.2 混合菌生物被膜的特定活菌數(shù)檢測(cè) 將3 種稀釋液1∶1∶1 混合后以1%的接種量接種于裝有不銹鋼片的TSB 試管中，按照2.3.1 節(jié)方法制備稀釋液，選擇1 mL 適宜稀釋度液加入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，并傾注冷卻至45 ℃的Hektoen Enteric 瓊脂培養(yǎng)基、Baird-Parker 瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)48 h 后菌落計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線[15-16]。

2.4 混合菌和單一菌生物被膜中金黃色葡萄球菌毒素基因表達(dá)量的差異

2.4.1 混合菌和單一菌生物被膜的建立及總RNA的提取 混合菌生物被膜和金黃色葡萄球菌生物被膜按照2.1 節(jié)的方法建立培養(yǎng)24 h 后，將漂洗干凈的不銹鋼片放入裝有1 mL Trizol 試劑的試管中，振蕩后嚴(yán)格按照Trizol 操作說(shuō)明提取總RNA，每個(gè)樣品3 個(gè)平行樣[17]。

2.4.2 熒光定量PCR 相對(duì)定量毒素基因

2.4.2.1 逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 采用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 進(jìn)行 cDNA反轉(zhuǎn)錄，試驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.4.2.2 Real Time PCR 樣本檢測(cè) 試驗(yàn)對(duì)四大類的28 種金黃色葡萄球菌毒素基因進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，引物均由北京Invitrogen 公司合成。以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌（CMCC 26003-3）為對(duì)照樣品，計(jì)算出單一菌和混合菌生物被膜中金黃色葡萄球菌28 種特有毒素基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。每個(gè)樣本均做3 個(gè)平行樣。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析：

表1 熒光定量PCR 反應(yīng)引物序列Table 1 Primers sequences used for quantitative real-time PCR

（續(xù)表1）

3 結(jié)果與分析

3.1 銀染法對(duì)混合菌生物被膜形態(tài)的觀察

圖1為培養(yǎng)0.5，1，3，5，7 d 混合菌生物被膜的形態(tài)，圖中黑色絮狀膜樣物即為生物被膜。由圖1a 可知，在培養(yǎng)0.5 d 時(shí)3 種病原菌的混合菌體生長(zhǎng)速率較為緩慢，僅形成微量生物被膜且分布比較分散，因?yàn)榇穗A段為生物被膜黏附期，為生物被膜形成的第一步，此期的細(xì)菌形成量少且狀態(tài)不穩(wěn)定，食品工業(yè)中清除生物被膜常在此階段進(jìn)行。圖1b 和圖1c 時(shí)期的生物被膜形成量多，尤其在培養(yǎng)1 d 時(shí)，黑色絮狀物緊密聯(lián)結(jié)在一起形成大片生物被膜，在3 d 時(shí)的被膜量雖然有所減少，但仍有小片聯(lián)結(jié)的生物被膜，隨著微生物細(xì)胞的不斷分裂增殖，并分泌了大量胞外多聚糖（EPS），此時(shí)單個(gè)細(xì)菌聚集形成微小集落以形成高度有組織的成熟生物被膜。成熟后的生物被膜隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，其內(nèi)的微生物細(xì)胞會(huì)快速增殖分散，致使一部分微生物脫落，如圖1d、1e 所示，生物被膜已呈分散狀態(tài)，僅有微量甚至是單個(gè)菌體存在[19]。

圖1 不同時(shí)間段混合菌生物被膜的形態(tài)（×200）Fig.1 Morphology of mixed biofilms in different time periods（×200）

3.2 掃描電鏡對(duì)混合菌生物被膜形態(tài)的觀察

用掃描電鏡觀察0.5，1，3，5，7 d 的混合菌生物被膜形態(tài)（圖2）發(fā)現(xiàn)，混合菌生物被膜的生長(zhǎng)狀態(tài)符合銀染法觀察到的黏附期-成熟期-脫落期三階段。在0.5 d（圖2a）時(shí)，微生物以單個(gè)形式存在，分布也較為分散；在1 d（圖2b）時(shí)3 種病原菌分泌的胞外多糖等物質(zhì)將自身及其余兩種菌包裹后形成大片粘連緊密的生物被膜；由圖2c 可清晰看出膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但此時(shí)的生物被膜已稍有松動(dòng)趨勢(shì)；處于脫落期（圖2d、2e）的混合菌生物被膜只可見(jiàn)稀松的單個(gè)菌體和細(xì)菌分泌的胞外多糖及其它有機(jī)物質(zhì)。由圖2可知，在大腸桿菌-金黃色葡萄球菌-腸炎沙門(mén)氏菌的混合菌生物被膜中，球狀菌體（金黃色葡萄球菌）明顯大于桿狀菌體（大腸桿菌和腸炎沙門(mén)氏菌）數(shù)量，這是因?yàn)樵诨旌喜≡锉荒ぶ校锾m氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌存在競(jìng)爭(zhēng)作用，優(yōu)勢(shì)菌（金黃色葡萄球菌）在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的物質(zhì)會(huì)抑制其它兩株菌的生長(zhǎng)[20]。

圖2 不同時(shí)間段混合菌生物被膜的形態(tài)（×5 000）Fig.2 Morphology of mixed biofilms in different time periods（×5 000）

3.3 結(jié)晶紫染色法對(duì)混合菌生物被膜形成量的檢測(cè)

采用結(jié)晶紫染色法對(duì)混合菌生物被膜形成量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

如表2所示，5 個(gè)時(shí)間段的SI 均大于1，即混合菌（大腸桿菌-金黃色葡萄球菌-沙門(mén)氏菌）在培養(yǎng)0.5，1，3，5 和7 d 均能形成生物被膜。在培養(yǎng)1 d 時(shí)為強(qiáng)黏附，混合菌生物被膜SI=4.11；0.5，3，5 d 均可生成中等量生物被膜（2

表2 不同時(shí)間段生物被膜的形成能力Table 2 Biofilm formation ability in different time periods

3.4 食源性病原菌生物被膜內(nèi)活菌數(shù)的定量

圖3和圖4為3 種細(xì)菌單獨(dú)及混合后其生物被膜中各個(gè)活菌數(shù)隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)曲線。在單一菌生物被膜中（圖3），大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌生物被膜活菌數(shù)均隨培養(yǎng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，且在培養(yǎng)24 h 時(shí)活菌數(shù)目達(dá)到最大；金黃色葡萄球菌則明顯高于其它兩株。在混合菌生物被膜中（圖4），各個(gè)菌株也均于培養(yǎng)24 h 時(shí)達(dá)到最大生長(zhǎng)量，金黃色葡萄球菌在混合菌生物被膜中為優(yōu)勢(shì)菌。對(duì)比單一菌和混合菌生物被膜中各個(gè)活菌數(shù)可知，3 株菌在混合菌生物被膜中為相互競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，分別通過(guò)分泌有機(jī)物質(zhì)抑制了其余兩株細(xì)菌的生長(zhǎng)。以24 h 時(shí)來(lái)說(shuō)，混合菌中的金黃色葡萄球菌活菌數(shù)目下降率為26.7%，大腸桿菌為23.2%，沙門(mén)氏菌為40.1%。

圖3 單菌生物被膜中活菌數(shù)目Fig.3 Number of bacteria in single bacteria biofilm

圖4 混合菌生物被膜中活菌數(shù)目Fig.4 Number of bacteria in mixed bacteria biofilm

3.5 混合菌和單一菌生物被膜中金黃色葡萄球菌毒素基因表達(dá)量的差異

根據(jù)Real Time PCR 原始檢測(cè)結(jié)果，按照2-△△CT 相對(duì)定量計(jì)算，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，28 種毒素基因均可在金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌中檢出。相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)菌株，除單一菌中的hla、hld、etd 及混合菌中ser、hld 毒素基因外，其余基因表達(dá)量均低于標(biāo)準(zhǔn)菌?；旌暇噍^于單一菌生物被膜，金黃色葡萄球菌毒素基因表達(dá)量上調(diào)的有sea、sec、seg、sei、sej、sem、sep、ser、seu、hld、hlg、coa；下調(diào)的基因有sed、see、seh、sek、sel、sen、seo、seq、hla、hlb、pvl、eta、etb、etd、tst；混合菌中上調(diào)量顯著的基因有sep、ser，顯著下降的為hla、etd，其中seb 在單一菌和混合菌生物被膜中的表達(dá)量相等。

表3 Real Time PCR 檢測(cè)相對(duì)定量結(jié)果Table 3 Real Time PCR detects relative quantitative results

金黃色葡萄球菌在感染過(guò)程中的主要致病毒素為腸毒素（SEs），SEs 易溶于水且耐高溫，肉蛋乳等淀粉和蛋白質(zhì)含量高的食品易被SEs 污染[21]，因此本研究對(duì)18 種調(diào)控腸毒素的因子（sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、sej、sek、sel、sem、sen、seo、sep、seq、ser 和seu）進(jìn)行了相對(duì)定量，除ser 在混合菌生物被膜中表達(dá)量顯著上調(diào)外，其余均比金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌表達(dá)量低。金黃色葡萄球菌溶血素（HL）能夠破壞宿主紅細(xì)胞從而引發(fā)血小管平滑肌收縮、局部缺血甚至壞死等問(wèn)題[22]，研究的4 種溶血素調(diào)控因子（hla、hlb、hld 和hlg）檢出率為100%，hla 在單一菌生物被膜中明顯上調(diào)，hld 在單一菌和混合菌中表達(dá)量均顯著增加。殺白細(xì)胞素（pvl）是金黃色葡萄球菌另一種毒素基因，可破壞宿主吞噬細(xì)胞而引發(fā)致死性肺炎[23]，Pvl 在生物被膜中微量下降。脫皮毒素（ETs）、中毒性休克綜合征毒素（TSST）和凝固酶（CaL）為金黃色葡萄球菌的重要致病毒素[24-26]，調(diào)控基因除etd 在單一菌中表達(dá)量顯著上調(diào)外，eta、etb、tst 和coa 均下降。

在食品工業(yè)中，金黃色葡萄球菌形成的生物被膜比浮游菌危害性大且更難以清除。雖然試驗(yàn)檢測(cè)出生物被膜中的毒素基因大多比浮游菌的表達(dá)量低，但是由ica 操縱子（含icaA、icaB、icaC、icaD 基因）調(diào)控的多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesin，PIA）大量增加，使得生物被膜緊密聯(lián)結(jié)在一起以便抵抗外部不良環(huán)境?；旌暇锉荒ひ蚨嗵丘じ剿嘏c復(fù)雜多樣的胞外有機(jī)物質(zhì)相互粘連進(jìn)一步形成了更加完善緊密的微系統(tǒng)，使毒素可長(zhǎng)時(shí)間作用于宿主且不易被外源藥物殺滅[27-29]。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)銀染法和掃描電鏡法對(duì)食源性混合病原菌生物被膜進(jìn)行定性檢測(cè)，使用結(jié)晶紫染色法對(duì)生物被膜的形成量進(jìn)行測(cè)定，并通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)單一菌和混合菌生物被膜中的活菌數(shù)目進(jìn)行定量。研究表明，混合菌在培養(yǎng)1 d 時(shí)即可形成成熟生物被膜；對(duì)其活菌數(shù)定量后發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌為優(yōu)勢(shì)菌，且其在混合菌生物被膜中生長(zhǎng)量明顯低于單一菌；進(jìn)一步使用熒光定量PCR 發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌28 種毒素因子在混合菌和單一菌生物被膜中表達(dá)量各不相同。金黃色葡萄球菌具有強(qiáng)致病性，且極易與其它病原菌形成混合菌生物被膜，增強(qiáng)了其致病性和難清除性。因此，在食品實(shí)際加工生產(chǎn)中應(yīng)實(shí)時(shí)防控和滅菌，避免混合菌生物被膜造成食品細(xì)菌性污染等問(wèn)題。