杜宏，呂欣然，崔曉玲，高永悅，白鳳翎*，儀淑敏，勵建榮，郭曉華，謝晶

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州121013；2.山東美佳集團有限公司，山東日照276800；3.上海海洋大學食品學院，上海201306）

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM），簡稱單增李斯特菌，是一種兼性厭氧型、無芽孢、革蘭氏陽性短桿菌[1]。該菌能在低溫環(huán)境中生長，是冷藏食品中常見的一種食源性致病菌[2]，廣泛存在于肉制品、水產(chǎn)品、果蔬制品和奶制品等產(chǎn)品中。在食品加工過程中，能夠定植在生產(chǎn)設備和食品表面形成生物膜、不易被徹底滅活從而造成產(chǎn)品腐敗或引起食源性疾病[3-4]。單增李斯特菌感染多數(shù)出現(xiàn)在新生嬰兒、老人及孕婦等免疫缺陷人群，致死率高達20%～30%[5]。

生物膜（bioflim，BF）是指通過附著在有生命或無生命生物體表面的細胞外聚合物結(jié)合在一起的細胞，這種細胞需通過細胞間的相互作用而聚集，形成穩(wěn)定的多細胞簇[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，超聲波處理和外加電場等物理方法可有效避免細菌耐藥性，但是不能完全消除或減少生物膜的黏附[8]；用次氯酸鈉、過氧乙酸等化學消毒劑可有效清除生物膜[9]，但是清除效率與其濃度有很大關系，易造成化學殘留等問題；添加肉桂醛、丁香酚等植物提取物可有效抑制單增李斯特菌生物膜的形成[10]，但植物提取物存在原材料成本高、提取工藝復雜等問題。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是利用外界環(huán)境中碳水化合物代謝產(chǎn)生乳酸的一類細菌的統(tǒng)稱。LAB代謝產(chǎn)生有機酸、過氧化氫、細菌素等物質(zhì)對腐敗菌、致病菌及其生物膜的形成有一定的抑制作用[11]。KANG等[12]發(fā)現(xiàn)2株來源于兒童唾液的食寇魏斯氏菌（Weissella cibaria）CMS1和CMS3能夠顯著抑制變異鏈球菌生物膜的形成。劉文婷等[13]發(fā)現(xiàn)由植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）B23產(chǎn)生的細菌素Lac-B23對熒光假單胞菌具有明顯的抑制作用，并且對生物膜的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)具有明顯的破壞作用。本文從東北傳統(tǒng)酸菜分離篩選出對單增李斯特菌具有拮抗作用的低溫型乳酸菌，分析其對單增李斯特菌生物膜形成和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，為研發(fā)生物制劑控制食品中單增李斯特菌提出一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes ATCC 9115）：渤海大學食品科學與工程學院微生物學與分子生物學實驗室保藏； 乳酸菌菌株 Z01、Z03、Z04、Z05、Z06、Z07、K03、K04、S01、S02、S03、S04：分離自錦州恒隆實業(yè)有限公司東北傳統(tǒng)酸菜產(chǎn)品。

1.1.2 培養(yǎng)基及生化試劑

MRS瓊脂培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯、LB肉湯：北京奧博星生物技術有限公司；乳酸菌生化鑒定管：杭州天和微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒、DNA marker-D、Taq PCR Master mix：上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

DL-CJ-2N超凈工作臺：北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；GI54DS高壓滅菌鍋：致微儀器有限公司；SPX-250生化培養(yǎng)箱：寧波海曙賽福實驗儀器廠；5804R高速冷凍離心機：德國艾本德公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；DZF-6050型真空干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；BMM-408YS顯微鏡：上海澮統(tǒng)光學儀器有限公司；DYY-8C電泳儀：北京市六一儀器廠；Cheimdox XRS凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；IKA Vortex GENIUS 3振蕩器：德國IKA公司；MS105UD電子分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；Czone 5F抑菌圈測量及菌落計數(shù)儀：杭州迅數(shù)科技有限公司；PE Victor X3酶標儀：美國珀金埃爾默公司。

1.3 方法

1.3.1 低溫生長型乳酸菌的篩選

將從東北酸菜中分離的菌株以2.0%接種于MRS肉湯中，37℃培養(yǎng)12 h，重復3次。活化好的菌株接種于MRS肉湯中，10℃培養(yǎng)72 h，每隔24 h取樣測定乳酸菌的OD595nm值。

1.3.2 拮抗性乳酸菌的篩選

將活化好的乳酸菌接種于MRS肉湯中，37℃培養(yǎng) 12 h后，8 000 r/min離心 10 min，上清液用 0.45 μm濾膜過濾除菌，獲得乳酸菌無細胞上清液（cell free supernatants，CFS）。將單增李斯特菌以1.0%接種于LB肉湯中，37℃連續(xù)培養(yǎng)3代，菌懸液濃度調(diào)至106CFU/mL。參照文獻[14]采用牛津杯打孔法對單增李斯特菌的抑菌活性進行測定。

1.3.3 單增李斯特菌細胞表面特性分析

1.3.3.1 表面疏水性

使用非極性溶劑十六烷測定細胞表面疏水性/親水性。細菌細胞表面疏水性是決定細菌非特異性黏附到生物和非生物表面的最重要因素之一。將活化的單增李斯特菌菌懸液（50 mL）于4℃下7 000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，用0.85% NaCl洗滌兩次重懸，測定OD595nm（A0）。取上述溶液3.0 mL加入0.5 mL十六烷，振蕩 60 s，靜置 15 min 后，測定其 OD595nm（A1），設置3個平行。黏附率計算公式如下。

1.3.3.2 自動聚集能力

將單增李斯特菌以1.0%接種于LB肉湯中，37℃培養(yǎng)24 h后，于10℃自然沉降24 h，對照組利用無菌接種棒攪拌30 s。取200 μL溶液于96孔板，分別測定OD595nm，細胞自動聚集率計算公式如下。

式中：B1為試驗組OD595nm；B0為對照組OD595nm。

1.3.4 乳酸菌粗提物對單增李斯特菌生物膜的影響

1.3.4.1 乳酸菌粗提物的制備

取乳酸菌CFS（100 mL）置于分液漏斗中，分5次加入100 mL乙酸乙酯，混勻后靜置5 min，待分層后收集有機相，將有機相于50℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機溶劑，收集瓶中余液，真空冷凍干燥成粉末。

1.3.4.2 最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的測定

取單增李斯特菌培養(yǎng)液200 μL，接種到10 mL新鮮滅菌培養(yǎng)液中，加入不同濃度的乳酸菌粗提物100μL，使培養(yǎng)液中乳酸菌粗提物終濃度為2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0 mg/mL，同時設置空白對照。37℃振蕩培養(yǎng)24 h后，確定抑制細菌生長的最小濃度。

1.3.4.3 乳酸菌粗提物對單增李斯特菌生長的影響

取單增李斯特菌培養(yǎng)液（50 μL）于5.0 mL滅菌LB培養(yǎng)液中，加入不同濃度的乳酸菌粗提物50 μL，使培養(yǎng)液中乳酸菌粗提物終濃度為0.5 MIC和1.0 MIC，以加菌液為對照組，37℃振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h測其OD595nm。

1.3.4.4 乳酸菌粗提物對單增李斯特菌生物膜黏附細菌的影響

參考林洋等[15]的方法，并稍作修改。將不銹鋼切片（stainless steel，SS） 用無水乙醇浸泡30 min后無菌水沖洗，再用1.0 mol/L NaOH浸泡后無菌水沖洗，待干燥后，置于24孔板中。取10 μL過夜培養(yǎng)的單增李斯特菌菌懸液和1.0 mL滅菌LB肉湯加入含有切片的24孔板中，分別加入10 μL不同濃度的乳酸菌粗提物，使粗提物終濃度為0、0.5 MIC和1.0 MIC，37℃培養(yǎng)72 h。每隔12 h取出不銹鋼切片置于10 mL無菌水的錐形瓶中（含有直徑6 mm的玻璃珠）攪拌10 min，采用傾注法倒入LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，計算每平方厘米貼壁細胞數(shù)量。

1.3.4.5 乳酸菌粗提物對單增李斯特菌生物膜形成的影響

參照孫夢桐[16]的方法，在96孔板中每孔加入180 μL單增李斯特菌菌懸液和20 μL乳酸菌粗提物，對照用MRS肉湯。37℃培養(yǎng)24 h后，移出孔內(nèi)培養(yǎng)液，用200 μL無菌水清洗3次～5次，再添加200 μL 0.4%結(jié)晶紫染色5 min，用無菌水清洗3次，置于60℃恒溫干燥箱干燥10 min，每個孔中加入200 μL 95%乙醇，從孔中移出150 μL到另一96孔板內(nèi)，用酶標儀測定OD595nm。

式中：ODc為單增李斯特菌菌懸液OD值；ODt為粗提物處理組的OD值。

1.3.4.6 乳酸菌粗提物對單增李斯特菌生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

光鏡觀察：將無菌蓋玻片（R=1.4 cm）置于24孔板中，孔內(nèi)加入1 mL LB肉湯和10 μL單增李斯特菌懸液及100 μL不同濃度乳酸菌粗提物，37℃培養(yǎng)24 h后，用無菌水潤洗蓋玻片3次，0.4%結(jié)晶紫染色20 min，油鏡下觀察。

掃描電鏡觀察：前處理步驟同光鏡觀察（除染色外），而后4℃條件下用體積分數(shù)2.5%的戊二醛固定12 h。用無菌水洗去殘留的戊二醛，再用40%、70%、90%、100%乙醇脫水處理各15 min，蓋玻片真空干燥，噴金，掃描電鏡觀察。

1.3.5 乳酸菌的鑒定

1.3.5.1 生理生化反應

生理生化反應參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[18]對乳酸菌菌株進行生理生化鑒定。

1.3.5.2 16S rDNA序列分析

16S rDNA序列分析參照文獻[19]，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR） 應用 25 μL 擴增反應體系：擴增引物為 27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3′各1.0 μL，DNA 模板 1.0 μL，Taq PCR Master mix 12.5 μL，超純水9.5 μL。 PCR擴增反應程序：94℃2 min，94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 90 s，循環(huán) 30次，4℃保溫。PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳并照相，將擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比對，MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

每項試驗重復3次，采用平均值±標準差處理數(shù)據(jù)。SPSS19.0進行數(shù)據(jù)分析和Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 低溫生長型乳酸菌的篩選

溫度是微生物生命活動中重要的環(huán)境因素，微生物必須通過基因調(diào)控和RNA的合成以適應環(huán)境溫度[20]。圖1為12株乳酸菌在10℃培養(yǎng)24 h后OD值變化結(jié)果。

圖1 12株乳酸菌在不同時間下OD595nm測定結(jié)果Fig.1 Measurement OD595nmresults of 12 strains lactic acid bacteria at different times

結(jié)果表明，菌株Z01、K04的OD值顯著性增加，表明菌株Z01和K04可以快速適應低溫環(huán)境持續(xù)生長。菌株K03、S02、S03的OD值顯著性降低，說明其在低溫條件生長繁殖緩慢。其它菌株OD值未發(fā)生明顯改變。48 h后12株乳酸菌OD值均顯著性增加，表明低溫條件下12株乳酸菌均可生長。培養(yǎng)72 h后OD值的增加量在0.06～0.23之間，其中菌株Z01增加量最大，該菌株能夠更好地在低溫條件下生長。

2.2 拮抗性乳酸菌的篩選

圖2為乳酸菌對單增李斯特菌的抑菌結(jié)果。

圖2 12株乳酸菌對單增李斯特菌抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of 12 strains of lactic acid bacteria on Listeria monocytogenes

由圖2可知12株乳酸菌對單增李斯特菌均有抑菌活性，抑菌圈直徑在15.02 mm～19.79 mm之間，其中菌株Z01的抑菌圈直徑為（19.79±1.21）mm，作用最強。綜合低溫性和抑菌活性，選擇菌株Z01進行后續(xù)試驗。

2.3 單增李斯特菌細胞表面特性

生物膜形成不僅取決于附著表面的性質(zhì)，還取決于細菌細胞表面的特性。細胞表面疏水性和自動聚集能力可調(diào)節(jié)細胞間和細胞與表面的附著[21]。試驗結(jié)果表明：單增李斯特菌對十六烷的黏附率和自動聚集率分別為（24.2±2.1）%和26.9%，說明該菌不具有顯著的表面疏水性，具有較好的自動聚集能力，易在親水性表面形成生物膜，因此選用親水性不銹鋼表面繼續(xù)進行研究。

2.4 乳酸菌粗提物對生物膜形成的影響

2.4.1 對單增李斯特菌生長的影響

圖3為菌株Z01不同濃度粗提物對單增李斯特菌生長的影響。

圖3 不同菌株Z01粗提物濃度作用下單增李斯特菌生長曲線Fig.3 Growth curve of L.monocytogenes at different concentrations of strain Z01 crude extracts

由圖3可以看出，乳酸菌粗提物對單增李斯特菌的MIC為16.0 mg/mL。對照組中單增李斯特菌生長呈正常趨勢，在0～8 h內(nèi)菌株快速增長，隨著時間延長和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，生長緩慢，進入穩(wěn)定。當用濃度為0.5 MIC粗提物處理時，培養(yǎng)24 h后，單增李斯特菌的數(shù)量下降了29.24%。用濃度為1.0MIC粗提物處理時，單增李斯特菌被完全抑制。呂欣然等[22]研究發(fā)現(xiàn)，當用濃度為0.4MIC的植物乳桿菌DL3粗提物處理單增李斯特菌時，其可縮短目標菌的生長速率和生長周期，與本文研究結(jié)果相似。

2.4.2 對單增李斯特菌生物膜黏附作用的影響

生物膜的形成是一個動態(tài)過程，包括細菌起始黏附、生物膜發(fā)展和成熟擴散等階段[23]。圖4為乳酸菌粗提物影響單增李斯特菌生物膜黏附作用的生長曲線圖。

細菌在生長繁殖的同時分泌大量胞外聚合物黏附細菌，對物體表面的黏附更為牢固，為生物膜形成初期。由圖4可知，0～12 h不銹鋼片上黏附的細菌菌落數(shù)呈對數(shù)增長，12 h～48 h黏附菌落數(shù)增長速度減慢。在此階段，處理組中隨著粗提物濃度增加，單增李斯特菌生長滯后，生物膜黏附細菌數(shù)量逐漸減少，顯著抑制生物膜形成。在48 h～72 h細菌數(shù)量趨于穩(wěn)定，生物膜形成基本處于成熟期。此時黏附細菌數(shù)隨著粗提物濃度增加而顯著減少，抑制生物膜的作用顯著，表明生物膜的穩(wěn)定性或覆蓋率降低。該結(jié)果與楊維等[24]研究溴化呋喃酮對單增李斯特菌生物膜黏附作用的影響結(jié)果一致。

圖4 菌株Z01粗提物作用下單增李斯特菌生物膜黏附細菌生長曲線Fig.4 Growth curve of adherent colonies in L.monocytogenes biofilm strain Z01 crude extracts

2.4.3 對單增李斯特菌生物膜抑制作用

2.4.3.1 96孔板法測定抑制率

菌株Z01粗提物濃度為0.5MIC、1.0MIC時，對單增李斯特菌生物膜抑制率分別為59.33%和77.77%，表明隨著濃度升高，抑制作用增強。根據(jù)2.4.1中結(jié)果，當粗提物濃度升高時，對單增李斯特菌生長的抑制作用增強，所以可能是抑菌物質(zhì)濃度提高，使得抑制生物膜作用隨之增強。Camargo等[25]研究發(fā)現(xiàn)含有細菌素的乳酸菌無細胞上清液可以抑制單增李斯特菌生物膜的形成，而菌株Z01粗提物中何種物質(zhì)抑制生物膜形成有待進一步確定。

2.4.3.2 光學顯微鏡及掃描電鏡觀察

菌株Z01粗提物對單增李斯特菌生物膜形態(tài)的作用結(jié)果如圖5所示。

圖5 菌株Z01粗提物對單增李斯特菌生物膜形態(tài)的影響Fig.5 Effect of crude extract of strain Z01 on the bio-film morphology of Listeria monocytogenes

結(jié)果表明，菌株Z01粗提物對單增李斯特菌生物膜形成具有顯著抑制作用。對照組中菌體相互連接，形成成熟且致密的生物膜，而處理組隨著粗提物濃度增加，生物膜生成量逐漸減少，菌體分散，生物膜稀疏，密度明顯降低，表明其抑制生物膜形成具有劑量效應。 掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）結(jié)果顯示，對照組生物膜基質(zhì)明顯增加，并且大量的微菌落連接形成致密的生物膜結(jié)構(gòu)。處理組中的生物膜由少量菌落構(gòu)成，隨著粗提物濃度的增加，單增李斯特菌生物膜形成量顯著減少。當粗提物濃度為1.0MIC時，菌體分散未形成生物膜。結(jié)果表明菌株Z01粗提物可抑制單增李斯特菌的聚集、黏附以及生物膜的形成[26]。

2.5 乳酸菌的鑒定

2.5.1 生理生化反應

表1為菌株Z01的生理生化鑒定結(jié)果，初步判定菌株Z01為融合魏斯氏菌（Weissella confusa）。

表1 菌株Z01生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical test results of strain Z01

2.5.2 16S rDNA序列分析

菌株Z01 16S rDNA基因擴增電泳圖及系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6所示。

圖6 菌株Z01的16S rDNA基因擴增電泳圖及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 PCR amplification of 16S rDNA gene and the phylogenetic tree for sequences of strain Z01

將PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，結(jié)果在1 500 bp左右出現(xiàn)特異性亮帶，表明目標片段被成功擴增。16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹對比發(fā)現(xiàn)菌株Z01和融合魏斯氏菌（Weissella confusa）KU324936.1的 16S rDNA最為相似，支持率為99%。確證菌株Z01為融合魏斯氏菌。

3 結(jié)論

本文從東北傳統(tǒng)酸菜中獲得一株對單增李斯特菌具有較強拮抗作用的融合魏斯氏菌Z01，其粗提物對單增李斯特菌的MIC為16.0 mg/mL。當作用濃度為0.5 MIC粗提物處理單增李斯特菌時，單增李斯特菌的數(shù)量減少了29.24%。當粗提物濃度為0.5 MIC和1.0 MIC時，對生物膜的形成抑制率以及對生物膜黏附細菌的抑制率分別為 59.33%、77.77%和14.49%、26.44%。此外，光鏡和掃描電鏡觀察研究發(fā)現(xiàn)粗提物對單增李斯特菌生物膜形成數(shù)量及生物膜形態(tài)具有顯著的影響，該菌株可作為研發(fā)低溫條件下控制單核細胞增生李斯特菌的生物制劑的出發(fā)菌株。