楊夢(mèng)婕，徐玲麗，馬學(xué)軍，武桂珍

（1.國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)醫(yī)學(xué)病毒和病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京102206；2.上海愛(ài)博才思分析儀器貿(mào)易有限公司，上海200335）

近年來(lái)全球食源性疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)出顯著上升的趨勢(shì)[1-2]，患者死亡率較高[3]。食源性疾病指的是經(jīng)過(guò)攝食途徑進(jìn)入到人體中的致病因子所引發(fā)的疾病，致病因子種類繁多，包括細(xì)菌、真菌和病毒等，而食源性致病菌以來(lái)源多樣、能在食品中迅速繁殖為特點(diǎn)而成為首要的致病因子，嚴(yán)重威脅著食品安全與人類健康[4-5]。 有研究顯示，肉及肉制品加工過(guò)程中發(fā)生的交叉污染導(dǎo)致的食物中毒發(fā)病率達(dá)到18.6%，單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等為重點(diǎn)致病菌檢測(cè)對(duì)象[6]，我國(guó)肉制品中致病菌的檢測(cè)相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)除上述4種致病菌外，還包含志賀氏菌、副溶血性弧菌等[7]，這些肉及肉制品中常見(jiàn)的致病菌與多數(shù)食源性疾病的爆發(fā)有關(guān)。

我國(guó)國(guó)標(biāo)中食源性致病菌的檢測(cè)多沿用傳統(tǒng)方法,耗時(shí)較長(zhǎng),不適宜應(yīng)對(duì)和控制大規(guī)模食源性疾病的爆發(fā)及食物中毒應(yīng)急處置。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)存在靈敏度偏低、檢測(cè)通量小等缺點(diǎn),市場(chǎng)上的商業(yè)化試劑盒成本高，不易普及推廣。因此,建立一種準(zhǔn)確、高效、靈敏的食源性病原菌檢測(cè)體系顯得頗為重要。本研究以大腸桿菌O157∶H7rfbE基因、金黃色葡萄球菌FemA基因、志賀氏菌ipaH基因、副溶血性弧菌tlh基因、單核細(xì)胞增生李斯特菌PfrA基因和沙門氏菌invA基因作為目標(biāo)基因，建立了基于多重基因表達(dá)（gene expression profiler,GeXP）遺傳分析系統(tǒng)的能同時(shí)檢測(cè)上述6種食源性致病菌的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)方法。該系統(tǒng)采用占主導(dǎo)地位的熒光標(biāo)記通用引物和特異性嵌合引物相結(jié)合建立多重PCR反應(yīng)體系，利用毛細(xì)管電泳分離檢測(cè)目標(biāo)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度及其熒光信號(hào)，根據(jù)片段大小區(qū)分不同的致病菌[8]，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)樣本同時(shí)進(jìn)行多種致病菌檢測(cè)，為食源性致病菌的快速檢測(cè)提供了新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與肉類樣本

大腸桿菌 O157∶H7 標(biāo)準(zhǔn)菌株（CI21530CC）、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC13565）、志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株[CMCC（B）51592]、副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC17082）、單核細(xì)胞增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC19115）、沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CMCC（B）50115）：上海SCIEX公司。

雞肉、牛肉、豬肉、羊肉：市售。

1.1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：天根公司；多重PCR擴(kuò)增試劑盒：凱杰公司；TSBYE培養(yǎng)基：上海廣銳生物科技有限公司；DNA marker（DSS400，DSS600）、分離緩沖液、上樣緩沖液、分離膠等：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機(jī)、移液器：Eppendorf公司；PCR儀：Thermo公司；GeXP遺傳分析系統(tǒng)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株基因組DNA提取

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Cat.#DP302）說(shuō)明書進(jìn)行基因組DNA提取。取1mL菌液，12000r/min離心2 min，收集菌體加溶菌酶、蛋白酶K及RNase進(jìn)行菌體裂解，56℃加熱30 min，然后相關(guān)溶液進(jìn)行抽提、洗脫，最終得純化 DNA60 μL，每 20 μL 分裝（避免反復(fù)凍融）于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及特異性驗(yàn)證

以大腸桿菌O157∶H7 rfbE基因、金黃色葡萄球菌FemA基因、志賀氏菌ipaH基因、副溶血性弧菌tlh基因、單核細(xì)胞增生李斯特菌PfrA基因和沙門氏菌invA基因作為目標(biāo)擴(kuò)增基因,所用引物序列參照SN/T 2641—2010《食品中常見(jiàn)致病菌檢測(cè)PCR-DHPL法》。在所有正反向引物的5’端分別加入一段非同源性特異序列構(gòu)成嵌合引物，該非同源性特異序列作為通用引物（Tag），Tag序列為 Tag-F:5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’和 Tag-R:5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’，其中正向通用引物Tag的5’端標(biāo)記熒光染料Cy5（Cy5-Tag-F）。所有引物由上海生工公司合成，其中Cy5-Tag-F引物采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）純化方式，其他特異性嵌合引物及反向通用引物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE） 方式純化。使用單重PCR法驗(yàn)證各引物特異性，確定各目的基因擴(kuò)增片段的實(shí)際大小。引物序列與目的擴(kuò)增產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

表1 引物序列與目的擴(kuò)增產(chǎn)物大小Table 1 Sequences of the primers and the size of the PCR products

續(xù)表1 引物序列與目的擴(kuò)增產(chǎn)物大小Continue table 1 Sequences of the primers and the size of the PCR products

1.3.3 GeXP多重PCR體系特異性及靈敏性驗(yàn)證

1.3.3.1 GeXP多重PCR體系的特異性驗(yàn)證

將6種標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA混合均勻作為GeXP多重PCR體系的模板，并向該體系加入對(duì)應(yīng)的6對(duì)引物，并設(shè)立陰性對(duì)照（以非目標(biāo)菌的DNA為模板）和空白對(duì)照（以無(wú)菌水為模板），根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度經(jīng)過(guò)多次引物濃度調(diào)整優(yōu)化，最終確定正反向混合引物中各嵌合引物的工作濃度為50 nmol/L～200 nmol/L，通用引物的工作濃度為10 μmol/L。多重PCR反應(yīng)體系為：2*MIX 12.5 μL，正反向嵌合引物混合物各2.5 μL， 正反向通用序列引物（10 μmol/L）1 μL，DNA模板1 μL,RNase-無(wú)菌水補(bǔ)足至25 μL。 參考Temperature Swich PCR[9]（TSP）原理反復(fù)優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增， 擴(kuò)增條件為:95℃，15s；95 ℃，30s；55℃，30 s；72 ℃，30 s，10 個(gè)循環(huán)；95 ℃，30 s；65℃，30s；72℃，30s，10 個(gè)循環(huán)；95℃，30s；48℃，30s；72℃，30 s，20 個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后取1 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行GeXP系統(tǒng)毛細(xì)管電泳，選用分析參數(shù)（Default GeXP Analysis Parameter DSS-600）進(jìn)行PCR產(chǎn)物的片段分析。

1.3.3.2 GeXP多重PCR體系的靈敏性驗(yàn)證

將6種標(biāo)準(zhǔn)菌的菌懸液（106CFU/mL）分別以10倍梯度稀釋后，提取基因組DNA進(jìn)行GeXP多重PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證該法的靈敏性。每個(gè)濃度均在非同日重復(fù)3次。同時(shí)構(gòu)建重組質(zhì)粒（人gapdh基因片段克隆至pTOPO-TA/Blunt Simple載體）作為該多重PCR體系的陽(yáng)性內(nèi)參。

1.3.4 實(shí)際樣本檢測(cè)

53份肉類樣品均采購(gòu)于正規(guī)超市和生禽市場(chǎng)，包括雞肉15份（雞肝、雞翅、雞頭）、牛肉10份、豬肉20份（豬肝、豬耳、豬臀尖）、羊肉8份。對(duì)各種肉類隨機(jī)取樣15 g加入到TSBYE培養(yǎng)液中，37℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜，第2天按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書取1.5 mL培養(yǎng)物進(jìn)行DNA提取，然后按1.3.3.1中GeXP多重PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重引物特異性驗(yàn)證

單重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)GeXP系統(tǒng)毛細(xì)管電泳分析，各靶基因擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相符，且每種菌的特異性引物只針對(duì)該菌，與其它菌均無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明引物的特異性好。

2.2 GeXP多重PCR體系特異性驗(yàn)證

分別以6種標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA為樣本，經(jīng)GeXP多重PCR擴(kuò)增后，每個(gè)反應(yīng)只出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的特異峰，結(jié)果如圖1所示，無(wú)非特異性峰出現(xiàn)，說(shuō)明該多重體系的特異性好。

圖1 多重PCR體系的特異性驗(yàn)證Fig.1 The specificity results of GeXP multiplex PCR system

2.3 GeXP多重PCR體系靈敏性驗(yàn)證

以 6 種標(biāo)準(zhǔn)菌株濃度分別為 106、105、104、103、102CFU/mL的混合液作待檢樣品，進(jìn)行GeXP多重PCR方法的靈敏度分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 多重PCR體系對(duì)混合模板靈敏性分析Fig.2 The sensitivity analysis of GeXP multiplex PCR system detection of mixed templates

結(jié)果表明，在103CFU/mL水平可以同時(shí)特異的檢測(cè)出6種致病菌。每個(gè)濃度均在非同日重復(fù)3次，獲得的結(jié)果相同（CV＜10%）。

2.4 實(shí)際樣本檢測(cè)

53份肉類樣品同時(shí)由SN/T 2641—2010和本研究建立的GeXP多重PCR法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果對(duì)比如表2所示。

表2 隨機(jī)樣品中致病菌不同檢測(cè)方法結(jié)果對(duì)比Table 2 The comparison results of different detection methods for pathogens in random samples

GeXP多重PCR法多檢測(cè)出的2份沙門氏菌陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)與沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株同源性達(dá)99%；其他3種菌（金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌）GeXP多重PCR法檢測(cè)均為陰性，經(jīng)行標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果也為陰性，兩者一致。

3 結(jié)論與討論

目前我國(guó)肉及肉制品中致病菌的檢測(cè)方法主要是采用傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，生化反應(yīng)鑒定等方法，耗時(shí)費(fèi)力，難以適應(yīng)現(xiàn)代食品生產(chǎn)的檢驗(yàn)需要，因此建立快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法有著非常重要的意義。近年來(lái)，由于多重PCR的高效性和經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，使得其越來(lái)越多地應(yīng)用在食品致病菌檢測(cè)領(lǐng)域，如雙重PCR方法檢測(cè)奇異變形桿菌與沙門氏菌，靈敏度分別為103CFU/mL和104CFU/mL；三重PCR技術(shù)快速檢測(cè)禽肉制品中沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，其靈敏度為102CFU/mL～103CFU/mL；多重PCR方法同時(shí)檢測(cè)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌等致病菌,其靈敏度為103CFU/mL～104CFU/mL[10-12]。本研究建立的GeXP多重PCR法靈敏度與這些文獻(xiàn)報(bào)道相似，但可同時(shí)檢測(cè)6種致病菌，是基于一種新的基因表達(dá)譜定量分析平臺(tái)[13]，該平臺(tái)將多重PCR和毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合,采用通用引物和特異性引物相結(jié)合的方法，經(jīng)多次優(yōu)化后保持兩者合適的比例以及各特異性引物的工作濃度比例，同時(shí)采用的三步法擴(kuò)增溫度（TSP法）及循環(huán)次數(shù)，使得整個(gè)體系擴(kuò)增過(guò)程中由通用引物占據(jù)主導(dǎo)作用，有效降低因多重PCR的擴(kuò)增偏愛(ài)性出現(xiàn)假陰性結(jié)果的概率[14]；同時(shí)通過(guò)毛細(xì)管電泳直接顯示產(chǎn)物片段長(zhǎng)度，更直觀簡(jiǎn)便判讀檢測(cè)結(jié)果。筆者已在前期工作中將該技術(shù)成功運(yùn)用于人乳頭瘤病毒[15]、食品中轉(zhuǎn)基因成分[16]及細(xì)菌氨基糖苷類耐藥基因[17]的檢測(cè)。

本研究建立了一種特異性高和靈敏性好的可以單管同時(shí)檢測(cè)肉及肉制品中6種常見(jiàn)致病菌的檢測(cè)方法，檢測(cè)限為103CFU/mL。但本方法也存在一些缺陷，毛細(xì)管電泳相對(duì)比較靈敏，故易出現(xiàn)交叉污染問(wèn)題，因此要盡可能減少操作步驟及提高人員操作的穩(wěn)定性；另外難以區(qū)分死菌和活菌造成的假陽(yáng)性，如何消除死菌對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響有待進(jìn)一步研究?？傊摲椒ň哂休^強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，但仍需要大量實(shí)際樣本的驗(yàn)證和進(jìn)一步優(yōu)化體系，希望進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)通量，在食品安全監(jiān)管領(lǐng)域有較強(qiáng)的實(shí)用推廣應(yīng)用價(jià)值。