汪 溪 汪惠琳曹 剛黎佳杰 陳松昌 馮祥瑞

（1江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌 330045；2南昌金牧動物保健服務(wù)有限公司，江西南昌 330013；3永豐縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊，江西永豐 331500）

哺乳動物生殖道是一種肌肉纖維結(jié)構(gòu)，分為黏膜層、肌肉層和外膜層。黏膜層形成許多稱為陰道褶皺的橫向褶皺，依次分為2層：固有層和鱗狀上皮層。從根本上講使上皮層與肌肉層相連的獨立結(jié)締組織是鱗狀上皮，其中存在的微生物群落被稱為陰道微生物群。在正常狀態(tài)下，陰道微生物在維持陰道健康和保護宿主免受疾病侵襲方面具有重要意義[1]。新的分子技術(shù)和計算機科學(xué)的出現(xiàn)使研究人員能夠深入探究陰道微生物群落組成，并將陰道微生物群落結(jié)構(gòu)與機體健康聯(lián)系起來[2]。盡管群落的結(jié)構(gòu)在不斷變化，但陰道菌群數(shù)量有限這一點已達成共識。陰道微生物群由多種厭氧和需氧微生物組成，其中乳酸菌是最主要的微生物，并在預(yù)防泌尿生殖系統(tǒng)疾病方面起決定性作用[3]。乳酸菌成為陰道防御者的主要原因是其產(chǎn)生的乳酸和H2O2能夠維持酸性環(huán)境，保持pH值約為4.0，對需氧性陰性細菌的生長不利[4,5]。在圍產(chǎn)期，母豬體內(nèi)殘留的雌激素會使陰道上皮增厚，使得糖原沉積在上皮細胞中，糖原通過上皮細胞脫落而釋放出來，有利于乳酸菌發(fā)酵葡萄糖[6]。母豬產(chǎn)后，體內(nèi)雌激素水平下降，陰道黏膜變薄，從而導(dǎo)致糖原和乳酸菌發(fā)酵葡萄糖減少，可提供多種需氧和兼性厭氧菌的生存環(huán)境。

益生菌（EM）是在適量服用后，對宿主健康有益的、活的微生物，能促進有益微生物的生長，抑制有害菌的繁殖。益生菌通常分為乳酸菌類和芽孢桿菌類，其中乳酸菌是一類能利用葡萄糖或乳糖產(chǎn)生大量乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性、球狀或桿狀細菌的總稱[7]。近年來，隨著消費者對動物食品安全的逐漸重視，人們對動物養(yǎng)殖模式不斷優(yōu)化，因益生菌無毒、無污染、無二重感染等特點成為替代抗生素的首選添加劑，用于疾病的預(yù)防和治療。作為水產(chǎn)生物、家禽、家畜飼料添加劑的益生菌，在促進動物健康生長的同時，能夠降低食品安全隱患，從而提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟效益[8]。近年來，乳酸菌也廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域治療陰道疾病，郭淑敏等[9]發(fā)現(xiàn)利用乳酸菌制劑治療RVVC（陰道假絲酵母菌病）療效優(yōu)于單純抗菌藥物。在養(yǎng)豬行業(yè)，多以母豬的繁殖性能為評價指標(biāo)，其生產(chǎn)性能決定了養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟效益，因此，提高母豬生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本是養(yǎng)殖戶追求的共同目標(biāo)。不同生理階段的母豬常伴隨發(fā)生消化、繁殖性疾病，而母豬的特殊生理期如妊娠、產(chǎn)仔、哺乳和斷奶等是不宜使用抗生素和抗菌藥物的，因而使用益生菌輔助或替代治療母豬的繁殖類疾病是當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)的需求。

菌群移植包括整體菌群移植（FMT）和選擇性菌群移植（SMT），SMT技術(shù)是將部分功能性菌群移植到消化道、生殖道、呼吸道及皮膚等部位，以改善移植部位菌群而治療相關(guān)疾病的一種方法。目前SMT技術(shù)還處于研究階段，發(fā)現(xiàn)和深入研究具有治療作用的新型優(yōu)勢益生菌株，是發(fā)展SMT的重要前提。產(chǎn)道內(nèi)的微生態(tài)系統(tǒng)在維持宿主健康中起著重要的作用，產(chǎn)道的黏膜上存在大量微生物，菌群平衡被打破易引起產(chǎn)道的相關(guān)疾病，及時增加益生菌含量對產(chǎn)道相關(guān)疾病的預(yù)防和治療有積極作用[10]。

本研究采集健康且窩產(chǎn)14頭的母豬產(chǎn)道分泌物進行分離純化出4株候選菌株。進一步對其中一株進行了生化鑒定、抗生素敏感性試驗、16S rDNA測序、體外抑菌試驗后確定該株菌為一株具有益生特性的糞腸球菌，為綠色防治母豬生殖道炎癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣本采集

在江西省南昌市安義神農(nóng)豬場，用121℃30 min高壓滅菌后的無菌母豬檢測用采樣器（專利：201920389 022.X）采集1頭窩產(chǎn)14頭仔豬的高產(chǎn)母豬產(chǎn)道中段分泌物，棉拭子立即放入事先準(zhǔn)備好的裝有500 μL生理鹽水的無菌EP管中并做好標(biāo)記，置于冰上再送回實驗室。放在-80℃超低溫冰箱保存。

1.1.2 試驗試劑

藥敏試紙片來自杭州微生物試劑有限公司，MRS培養(yǎng)基來自青島海博生物有限公司，革蘭氏染色試劑來自北京索來寶科技有限公司，菌株生化鑒定標(biāo)準(zhǔn)試劑盒、LB瓊脂培養(yǎng)基來自青島海博試劑有限公司；ddH2O為實驗室自制；DL 2 000 DNA Marker、Taq DNA聚合酶等均來自Takara公司。

1.1.3 試驗器材

恒溫培養(yǎng)箱來自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，高溫滅菌鍋來自上海中安醫(yī)療器械廠，高速離心機購自Eppendorf，Nanodrop、超低溫冰箱均購自美國Thermo公司，PCR儀來自中國東勝儀器有限公司，超凈工作臺來自蘇州凈化設(shè)備有限公司，瓊脂糖凝膠電泳儀來自北京六一儀器廠，紫外凝膠成像系統(tǒng)購自上海培清科技有限公司，厭氧罐及厭氧充氣罐購自廣州海太光電生物科技有限公司，顯微鏡購自道斯光學(xué)儀器公司，電阻爐購自北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的分離純化

在超凈工作臺上將裝有棉拭子的EP管中的生理鹽水混勻，取10 μL在MRS平板上劃線后放入?yún)捬豕薏⒊淙攵栊詺怏w，37℃厭氧培養(yǎng)48 h。再挑選形態(tài)不一的單個菌落參照《獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)》進行革蘭氏染色和鏡檢。在載玻片上滴一滴dd H2O，用接菌環(huán)勾取單個菌落的一半涂片，放在酒精燈上固定，再加結(jié)晶紫染色液初染1 min，緩慢水流沖洗后加碘液媒染1 min，再次水洗后加95%酒精脫色30 s，用水流沖掉酒精后加番紅復(fù)染1 min，最后水洗、自然晾干后鏡檢。將（40×100）油鏡下為藍色桿狀或球狀的菌留在MRS培養(yǎng)基上，單個菌落余下部分接入MRS液體培養(yǎng)基，4 000 r/min離心5 min棄上清，再加入1 mL 30%的甘油吹打混勻后放入-80℃超低溫冰箱保存菌種。

1.2.2 抗生素敏感性試驗

采用K-B紙片擴散法，選取常用抗生素氯霉素、紅霉素、恩諾沙星等共13種進行藥敏試驗。取200 μL按照1%比例復(fù)蘇的菌液用無菌棉簽在MRS平板上均勻涂布，待菌液完全滲透進培養(yǎng)基后，用酒精燈灼燒過的鑷子夾取藥敏紙片貼在平板上[11]。將處理好的平板放進厭氧罐并充入惰性氣體，37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑（mm）。

1.2.3 菌株生化鑒定

依據(jù)細菌的菌落形態(tài)及革蘭氏染色的鏡檢結(jié)果，參照菌株生化鑒定標(biāo)準(zhǔn)對分離菌株進行相關(guān)的生理生化試驗。將分離出來的菌株接種于明膠、七葉苷等微量生化反應(yīng)管中，放入37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.2.4 DNA提取及PCR擴增

用水煮法提取DNA。取1 mL過夜培養(yǎng)的分離菌菌液至1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心30 s后棄上清，再向EP管中加入1 mL dd H2O吹打混勻，12 000 r/min離心30 s后棄上清，重復(fù)操作1次，之后向EP管中加入100 ddH2O沸水浴20 min，再放入-20℃冰箱10 min后取出，待內(nèi)容物徹底融化后12 000 r/min離心1.5 min取上清。取2 μL上清用NanoDrop核酸濃度檢測儀檢測，結(jié)果符合進行PCR擴增的要求。

用水煮法提取所分離菌株的基因組DNA作為模板進行16S rDNA的PCR擴增，擴增引物為生工生物工程(上海)股份有限公司合成的細菌16S rDNA基因通用引物 27F（5’ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’） 和1 492R（3’-TACGGYTAC CTTGTTACGACTT-5’）。按照表1配置好25 μL反應(yīng)體系，配置好的PCR體系按照如下反應(yīng)條件進行PCR擴增。反應(yīng)條件為上樣后94℃預(yù)熱10 min，使模板DNA變性充分；接下來30個循環(huán)：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸100 s；最后72℃保持7 min，使產(chǎn)物延伸完整。取5 μL PCR產(chǎn)物和DL 2 000 DNA Marker經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳直至孔中所加樣品跑開，再用凝膠電泳成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。其余PCR擴增產(chǎn)物暫時放入4℃冰箱等待送檢。

表1 PCR反應(yīng)體系

1.2.5 序列同源性比對

將PCR擴增后的產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司湖南分公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源比對分析。

1.2.6 牛津杯法抑菌試驗

用大腸桿菌k88和變形桿菌作為指示菌，分別取200 μL在LB平板上用無菌棉簽均勻涂布，再將高壓滅菌后的牛津杯放在平板上，一個平板放入4個牛津杯，其中3個分別加入200 μL分離菌菌液，另一個加入200 μL營養(yǎng)肉湯作為陰性對照。室溫下放置30 min后放入37℃恒溫箱培養(yǎng)12 h，用直尺測量抑菌圈大小。

2 結(jié)果

2.1 分離純化結(jié)果

初步分離得到4株革蘭氏陽性菌，從其中挑選出1株命名為H8-4，以供后續(xù)試驗。H8-4鏡檢為球狀，呈短鏈排列的革蘭氏陽性菌。純化后在MRS培養(yǎng)基上菌落呈圓形、小而凸起、邊緣整齊、半透明、乳白色、表面光滑、濕潤（圖1）。

圖1 分離菌株初篩結(jié)果

2.2 抗生素敏感性試驗

表2結(jié)果表明青霉素、頭孢哌酮等對高產(chǎn)母豬產(chǎn)道分離的益生菌H8-4有良好的體外抑制效果，而紅霉素和阿奇霉素等對其無抑制作用。

2.3 分離菌生化鑒定

根據(jù)細菌生化鑒定管說明書對篩選出的H8-4進行判定，明膠、果糖等為陽性，葡萄糖酸鹽為陰性（表3）。

表3 分離菌生化特性

2.4 DNA提取及PCR擴增結(jié)果

NanoDrop核酸濃度檢測儀檢測用水煮法提取的高產(chǎn)母豬產(chǎn)道分離菌的DNA濃度為113 μg/mL，OD值為2.0，符合PCR擴增要求。

表2 藥敏試驗結(jié)果（mm）

PCR擴增后的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2所示，擴增條帶大小約1 500 bp。

圖2 H8-4電泳條帶

2.5 序列比對結(jié)果

將PCR擴增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司湖南分公司進行測序后結(jié)果用Chromas軟件打開，顯示如圖3，截去前后100個bp再在NCBI上進行Nucleotide BLAST比對，結(jié)果表明H8-4與Enterococcus faecalis sp.Le5-1a序列的同源性高達99.79%，登錄號為EU794735.1。由此可鑒定H8-4是糞腸球菌。

2.6 分離菌牛津杯法抑菌結(jié)果

在MRS平板上H8-4對變形桿菌的抑菌圈直徑分別為2.50 cm、2.41 cm、2.43 cm，平均抑菌圈大小為2.45 cm。H8-4對大腸桿菌抑菌圈直徑分別為2.31 cm、2.45 cm、2.33 cm，平均抑菌圈大小為2.45 cm。表明該株糞腸球菌對大腸桿菌和變形桿菌有較好的體外抑制作用。營養(yǎng)肉湯對照組未見抑菌圈。見表4和圖4。

3 分析與討論

3.1 分離菌的種屬

根據(jù)分離菌培養(yǎng)和生化特性，比對《伯杰氏細菌分離鑒定手冊》[12]，得知H8-4生化特性與糞腸球菌一致，再通過16S rDNA確定為糞腸球菌。糞腸球菌是一種天然的微生物鏈球菌，其存在于腸道中，主要通過影響宿主的免疫功能來對自身進行保護，在消化道中，糞便可以被降解為沼氣和CO2，在體內(nèi)還能產(chǎn)生一些有益的物質(zhì)；也可能將糞便分解成其他有害氣體和H2S等，這些成分能夠促進機體的新陳代謝。糞腸球菌還可以作為候選益生菌進行深入研究[13]。

3.2 分離菌的抗生素敏感性

抗生素敏感性試驗表明，H8-4對紅霉素、慶大霉素等抗生素表現(xiàn)為耐藥，對青霉素、頭孢哌酮等抗生素敏感性高。表明該株益生菌不含有青霉素、頭孢哌酮等的耐藥基因。

3.3 分離菌的生化特性

H8-4的生化特性與《臨床常見微生物鑒定指南》中糞腸球菌的明膠、七葉苷、葡萄糖酸鹽、半乳糖、乳糖、果糖、棉子糖等的生化試驗結(jié)果均一致。葡萄糖產(chǎn)氣試驗說明該株糞腸球菌產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

3.4 分離菌的益生性

H8-4對大腸桿菌k88和變形桿菌有良好的抑制作用，可作為益生菌候選優(yōu)勢菌株。

4 結(jié)論與展望

養(yǎng)殖業(yè)中濫用抗生素現(xiàn)象屢見不鮮，致使超級細菌不斷涌現(xiàn)。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2020年7月1日發(fā)布了“禁抗令”，嚴(yán)禁使用含促生長類藥物作為飼料添加劑，由此看來，益生菌的作用將顯得愈發(fā)重要。母豬生殖道炎癥是導(dǎo)致其繁殖性能下降的主要原因之一，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)生產(chǎn)效益。母豬生殖道疾病一般多由病原微生物單一感染或混合感染引起，細菌是最主要的病原微生物。益生菌能夠較好地防治陰道感染疾病，其作為人類和動物的重要組成部分，作用機理和種類也在不斷探索當(dāng)中。

產(chǎn)道菌群種類的改變和數(shù)量的失衡可引起產(chǎn)道炎癥，在SMT的原理基礎(chǔ)上提出母豬產(chǎn)道選擇性菌群治療方法的設(shè)想，分離并鑒定更多的母豬產(chǎn)道的益生菌將有利于篩選出優(yōu)質(zhì)、適應(yīng)性強的候選益生菌株。本試驗從實際出發(fā)，在高產(chǎn)母豬產(chǎn)道分離出1株糞腸球菌，糞腸球菌可以通過與各種細菌混合在一起來控制致病性微生物的生長和傳播。徐帥帥[15]對生豬腸道細菌菌群進行了alpha多樣性分析，得出在生豬腸道益生菌菌群中糞腸球菌占比68%。此外，有研究表明飼料中添加糞腸球菌可以顯著降低蝦的累計死亡率，明顯改善蝦腸道微生物群落的組成和豐度[16]。因此對不同益生性細菌的研究是非常有必要的。

席曉霞[17]的研究已證實，早期初產(chǎn)嬰幼兒的腸道菌主要可能遺傳自母體的生殖道。因此母豬產(chǎn)道中的益生菌可能更有利于初生仔豬在早期建立健康的腸道微生態(tài)平衡，從而保證仔豬腸道健康。

本試驗無菌采集江西省某養(yǎng)殖場窩產(chǎn)14頭仔豬的母豬產(chǎn)道中段陰道分泌物并成功分離了一株具有潛在益生性的糞腸球菌，對該菌的藥物敏感染性試驗中發(fā)現(xiàn)，該菌株對獸藥中常用的青霉素等敏感，提示其不存在與之相關(guān)的耐藥基因，初步具備了成為候選益生菌的條件，并為進一步的相關(guān)益生菌的篩選奠定了研究基礎(chǔ)。