鄭龍龍 潘國(guó)梅 張 黎*談小龍

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2云南省楚雄州祿豐縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南祿豐 652100；3安徽省六安市畜牧發(fā)展中心，安徽六安 237000）

輪狀病毒感染仔豬后常導(dǎo)致嘔吐、腹瀉、脫水和酸堿平衡紊亂[1]。病原體除輪狀病毒外，兒童及其他幼齡動(dòng)物體內(nèi)分離的輪狀病毒也可感染仔豬[2]，引起不同程度的發(fā)病癥狀，輪狀病毒是幼兒和多種新生動(dòng)物重要的腸道病毒，為人獸共患?。惠啝畈《灸芮趾θ撕驮S多家畜，給人類(lèi)健康和畜牧業(yè)的穩(wěn)定帶來(lái)巨大威脅[3]。目前尚無(wú)治療輪狀病毒感染的有效藥物，當(dāng)環(huán)境溫度下降和繼發(fā)大腸桿菌病時(shí)常使癥狀加重和幼畜死亡率增高[4,5]。

成年豬與育成豬多在晚秋、冬季和早春季節(jié)發(fā)病，多為隱性感染，是引起豬胃腸炎的常見(jiàn)病因。本病最早于1943年在患腹瀉兒童身上發(fā)現(xiàn)，1975年首次從豬體內(nèi)分離出輪狀病毒，目前本病呈世界性流行[6]。輪狀病毒在我國(guó)呈全國(guó)性流行，其抗體陽(yáng)性率最高可達(dá)95.7%，病毒陽(yáng)性率最高可達(dá)68.4%，且在腹瀉和非腹瀉豬群中均可檢測(cè)到[7]。當(dāng)前從各大洲分離到的輪狀病毒最流行的毒株仍是OSU，其基因型組合為G5P，我國(guó)主要流行的也是該類(lèi)毒株的輪狀病毒[8]。

2020年11月晉中市太谷區(qū)2個(gè)養(yǎng)殖戶從同一商品母豬場(chǎng)分別采購(gòu)500頭同批次50～70日齡12 kg仔豬，出現(xiàn)不同程度的腹瀉癥狀，使用抗生素效果差，豬群中40%出現(xiàn)脫水、昏迷癥狀，最終造成15%的傷亡率。為了探討該疾病的發(fā)生原因與相應(yīng)的防控工作，開(kāi)展本研究。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

無(wú)菌棉簽分別取A、B養(yǎng)殖戶80～100日齡架子豬肛拭子樣品各20份，置于1.5 mL EP管中4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)材料

輪狀病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬瘟病毒熒光RT-PCR核酸檢測(cè)試劑盒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬野毒gE基因熒光PCR核酸檢測(cè)試劑盒，以上試劑盒均購(gòu)自北京明日達(dá)科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)

取肛拭子樣品加入1 mL無(wú)菌生理鹽水混勻，使用麥康凱、SS培養(yǎng)基劃線分離培養(yǎng)；分離菌株培養(yǎng)物涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。采用紙片擴(kuò)散法涂抹在藥敏培養(yǎng)基上，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3.2 Q-PCR鑒定病毒

取1.3.1剩余樣品稀釋物4℃靜置30 min，10 000 r·min離心5 min，取上清液0.1 mL，提取總RNA或DNA；使用Q-PCR核酸檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、輪狀病毒和豬偽狂犬野毒。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)菌鑒定

40份樣品接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)基上出現(xiàn)了大小不等、帶有金屬光澤的紫黑色圓形菌落和無(wú)色半透明菌落。通過(guò)革蘭氏染色鏡檢，顯微鏡下觀察培養(yǎng)基上的2種形態(tài)相似的菌體，紫黑色菌落為革蘭氏陰性著色均勻的直桿菌、無(wú)芽孢、兩端鈍圓，菌體兩端偶爾略呈深染，與大腸桿菌染色特性相符[9]；無(wú)色半透明菌落為紅色短小桿菌，與沙門(mén)氏菌的染色特性相符[10]。

2.2 藥敏結(jié)果

大腸桿菌分離株對(duì)萬(wàn)古霉素、頭孢曲松敏感，對(duì)阿莫西林、新霉素、粘桿菌素、四環(huán)素、氨芐西林、丁胺卡那霉素、恩諾沙星、大觀霉素不敏感。沙門(mén)氏菌對(duì)大觀霉素、萬(wàn)古霉素敏感，而對(duì)阿莫西林、新霉素、粘桿菌素、恩諾沙星、丁胺卡那霉素、四環(huán)素、氨芐西林、林可霉素、頭孢曲松鈉不敏感。

2.3 Q-PCR結(jié)果

Q-PCR相關(guān)試劑盒對(duì)豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、輪狀病毒和豬偽狂犬野毒gE基因進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，40份樣品中輪狀病毒核酸100%呈陽(yáng)性，豬圓環(huán)病毒2型核酸30%為陽(yáng)性；豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬偽狂犬野毒均為陰性。

3 討論

仔豬腹瀉是由多種因素引起的一種腸道疾病，如果要診斷腹瀉病的病原，獸醫(yī)工作者除了需要有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)外，還需要借助實(shí)驗(yàn)室儀器的檢測(cè)。本研究對(duì)仔豬腹瀉中類(lèi)似豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、輪狀病毒和豬偽狂犬野毒等5種病毒及大腸桿菌、沙門(mén)氏菌混合感染時(shí)的發(fā)病情況、臨床癥狀病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，為病原的診療方向提供借鑒。腹瀉豬場(chǎng)的架子豬在發(fā)病的3 d前更換了飼料，這可能是引發(fā)本次豬腹瀉的誘因，造成本次仔豬腹瀉的病毒性病原主要是輪狀病毒、腸炎型豬圓環(huán)病毒2型，細(xì)菌性病原是多重耐藥性大腸桿菌和沙門(mén)氏菌，多種細(xì)菌和病毒的混合感染造成豬只的巨大傷亡。此外，該豬場(chǎng)是由雞棚改造而成的，在生物安全方面存在消毒不徹底，存在雞源耐藥性大腸桿菌和沙門(mén)氏菌感染豬群的可能性。提示雞棚改造成豬舍后需要多次徹底的清洗和消毒，并采樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)并評(píng)價(jià)消毒效果。

成年豬血清中輪狀病毒的抗體陽(yáng)性檢出率達(dá)40%～100%，且豬只一旦感染輪狀病毒，就會(huì)終生帶毒，難以凈化，且極易造成垂直傳播，帶毒仔豬受到應(yīng)激因素作用時(shí)隨時(shí)可能發(fā)病[11,12]。輪狀病毒在含有機(jī)物的外環(huán)境中非常穩(wěn)定，有過(guò)發(fā)病史的豬場(chǎng)常年存在，造成即便仔豬不攜帶病毒，也很容易被環(huán)境中的病毒所感染[13]。人工接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)接種輪狀病毒或溶血性大腸桿菌，只引起斷奶仔豬短暫的輕度腹瀉甚至呈亞臨床癥狀表現(xiàn)。但如果先接種輪狀病毒再接種溶血性大腸桿菌，則可發(fā)生類(lèi)似自然病例的持續(xù)性嚴(yán)重腹瀉[14-16]，與本病例臨床癥狀相同。我國(guó)有關(guān)輪狀病毒流行病學(xué)方面的研究數(shù)據(jù)相對(duì)較少且重視程度不足，雖然已經(jīng)有商品化疫苗可用，母豬免疫接種可以保護(hù)新生仔豬免受感染[17,18]，但在致病機(jī)理方面的研究仍有待深入。