陳強(qiáng) 劉立鳳 高越

光動力療法（PDT）是利用腫瘤細(xì)胞的高代謝特點(diǎn)來治療腫瘤的一種新方法，其原理是光敏劑可以選擇性地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并被特定波長的光激活，引起一系列光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生單線態(tài)氧和自由基，從而殺死腫瘤細(xì)胞［1］。血卟啉單甲醚（HMME）是常用的光敏劑，其介導(dǎo)的PDT已廣泛應(yīng)用于整形美容、細(xì)菌感染及惡性腫瘤的治療［2-4］，通過特定波長的激光來激活HMME可以產(chǎn)生腫瘤殺傷效應(yīng)，在內(nèi)窺鏡PDT治療中激光纖維通過內(nèi)窺鏡活檢通道進(jìn)入腔道，造成腫瘤的原位破壞而正常組織不受損傷，具有毒性局限、損傷小的特點(diǎn)，且反復(fù)PDT治療不易產(chǎn)生耐藥性［5］，目前用于胃癌的治療研究較少，本實(shí)驗(yàn)旨在研究HMME-PDT對胃癌細(xì)胞MGC-803的生長抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與光源 血卟啉單甲醚（凍干粉狀態(tài)）購自上海先鋒藥業(yè)有限公司，其最佳吸收光譜為630 nm［6］，胃癌細(xì)胞MGC-803系獲自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）均購自美國Hyclone Laboratories公司，鏈霉素和青霉素均購自蘇州碧云天生物技術(shù)公司，ApoAlert Annexin V-FITC試劑盒購自美國BD生物科技公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK8）購自武漢博斯特生物工程有限公司。選用的光源為二極管激光器（日本東京三洋電機(jī)株式會社），其最大輸出功率為260 mW，波長為635 nm。光通過具有0.8 mm圓柱形擴(kuò)散尖端的光纖施加器分布，照射前將輸出功率調(diào)整為50 mW，并將產(chǎn)生的光線進(jìn)行光學(xué)準(zhǔn)直至直徑為0.8 cm的光斑尺寸。激光輸出能量用功率計(jì)仔細(xì)校準(zhǔn)，以避免過度曝光。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將胃癌細(xì)胞MGC-803接種于含有10%胎牛血清、50 μg/ml鏈霉素和50 μg/ml青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含有5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 研究方法 （1）熒光檢測與光譜分析：將細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)基中，約1×104個/孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后，傾去原培養(yǎng)液，每個孔中加入一定量的HMME，并加入新的培養(yǎng)基，使之濃度為2 mg/L，每個孔設(shè)置四個復(fù)孔，分別孵育不同時間（0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min、270 min、300 min），采用波長405 nm、帶寬20 nm的光源照射，激發(fā)進(jìn)入胃癌細(xì)胞MGC-803的HMME發(fā)出熒光，使用光纖接收發(fā)出的熒光，采用Origin7軟件進(jìn)行熒光光譜分析，確定HMME的最佳孵育時間。（2）細(xì)胞形態(tài)觀察：在6孔板上培養(yǎng)的細(xì)胞與2 mg/L HMME孵育90 min（最佳孵育時間）后，用10 μg/ml DAPI（Hoechst 33342）染色10 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.4 細(xì)胞活力測定 將胃癌細(xì)胞MGC-803與不同濃度（0 mg/L～4 mg/L）的HMME在黑暗環(huán)境下孵育90 min后，行激光照射（波長630 nm，光功率50 mW，照射距離2 cm，照射面積0.5 cm2），輸出功率為100 mW/cm2；照射時間分別為0 s、20 s、40 s、80 s，產(chǎn)生的光能量強(qiáng)度分別為 0 J/cm2、2 J/cm2、4 J/cm2、8 J/cm2。然后在每個孔中加入10 μL CCK8試劑，將細(xì)胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，之后立即檢測490 nm處每個孔的光密度（OD）。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD-空白對照組OD）/（對照組OD-空白對照組OD）×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，采用單因素方差分析及Dunnett檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMME在胃癌細(xì)胞MGC-803中的聚集和熒光光譜分析 經(jīng)2 mg/L HMME孵育90 min的胃癌細(xì)胞MGC-803 用 10 μg/ml DAPI（Hoechst 33342）染色后，核染成藍(lán)色，紅色熒光代表MGC-803細(xì)胞中聚集的HMME，見圖1a；未與HMME孵育的細(xì)胞，細(xì)胞漿未顯示紅色熒光，見圖1b。胃癌細(xì)胞MGC-803的熒光強(qiáng)度隨著孵育時間的增加而迅速增加，在90 min達(dá)到峰值，然后急劇下降，并在210 min時達(dá)到另一個峰值，但低于前一個峰值，提示HMME與MGC-803細(xì)胞的最佳孵育時間為90 min，見圖2。

圖1 胃癌細(xì)胞MGC-803的熒光顯微照片

2.2 顯微鏡下胃癌細(xì)胞MGC-803的形態(tài)與數(shù)量變化 未經(jīng)HMME或光照射處理的胃癌細(xì)胞MGC-803呈長梭狀，邊緣銳利，見圖3a；經(jīng)2 mg/L HMME介導(dǎo)的PDT（4 J/cm2）誘導(dǎo)的MGC-803細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，變圓、起皺甚至破裂，存活的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，見圖3b。

圖 2 胃癌細(xì)胞MGC-803的HMME熒光光譜分析圖

圖3 胃癌細(xì)胞MGC-803的形態(tài)學(xué)變化

2.3 胃癌細(xì)胞MGC-803的存活率測定及分析 單純給予0.25 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L HMME孵育，未經(jīng)激光照射的胃癌細(xì)胞MGC-803幾乎無明顯變化；當(dāng)HMME濃度達(dá)到2 mg/L時，細(xì)胞存活率下降至（83.22±1.69）%（P=0.011）；HMME濃度達(dá)到4 mg/L時，細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降至（81.70±3.04）%（P=0.006）；HMME濃度達(dá)到8 mg/L時，細(xì)胞存活率（78.81±1.54）%下降更明顯（P=0.002）；可能是過量HMME引起的細(xì)胞毒性作用。單純用激光照射未經(jīng)HMME處理過的細(xì)胞，其存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；光強(qiáng)度為2 J/cm2時，細(xì)胞存活率為（94.68±2.73）%（P=0.44）；光強(qiáng)度為4 J/cm2時，細(xì)胞存活率為（92.62±6.22）%（P=0.48）；當(dāng)光強(qiáng)度增加至8 J/cm2時，存活率為（92.40±6.34）%（P=0.41）下降不明顯。當(dāng)與激光照射結(jié)合時，不同濃度的HMME可以實(shí)現(xiàn)不同程度的細(xì)胞抑制作用，即使使用最低濃度的HMME（0.25 mg/L）也可顯著降低胃癌細(xì)胞MGC-803的存活率（P＜0.01）。不同強(qiáng)度的光照亦存在這樣的趨勢。經(jīng)4 mg/LHMME和8 J/cm2的激光處理后，胃癌細(xì)胞MGC-803的存活率幾乎降低到最小值（5.63±1.51）%。當(dāng)HMME濃度達(dá)到8 mg/L，腫瘤細(xì)胞的存活率沒有再明顯降低（P=0.15）。見圖4a。

使用固定濃度的HMME作為光敏劑，不同強(qiáng)度的光照射對MGC-803細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的生長抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞MGC-803的存活率與光動力學(xué)因子B呈近似e指數(shù)衰減關(guān)系。光動力因子B=光輸出功率×照射時間×HMME濃度（B=I0×t×C）。見圖4b。

圖4 胃癌細(xì)胞MGC-803的存活率測定及分析圖。a. 與對照組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01，NS代表差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；b. 實(shí)心圓表示細(xì)胞存活率，紅色曲線顯示其與光動力學(xué)參數(shù)B的指數(shù)擬合

3 討論

光動力療法（PDT）是治療胃癌的新興替代方案，基于其靶向能力強(qiáng)、毒性低、治療效果好等特點(diǎn)，有學(xué)者認(rèn)為PDT是食管癌、胃癌和結(jié)腸癌患者的一線潛在療法［5，7］。光敏劑的選擇是充分發(fā)揮PDT療效的一個重要途徑，本研究使用的血卟啉單甲醚（HMME）為新開發(fā)的光敏劑，再次證明了PDT的功效，驗(yàn)證了HMME順利進(jìn)入MGC-803細(xì)胞。根據(jù)熒光檢測光譜的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，MGME-803細(xì)胞中HMME在90 min時達(dá)到濃度峰值，孵育時間過長會導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中均采取最佳孵育時間即90 min，以求在最佳時間內(nèi)達(dá)到最好的治療效果。HMME必須被激光激發(fā)以產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，如產(chǎn)生誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性氧（ROS）［5］，單純使用HMME處理腫瘤細(xì)胞是沒有殺傷效應(yīng)的（P＞0.05），而濃度超過2 mg/L時可單獨(dú)產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用（P＜0.05），由此可證明HMME對正常細(xì)胞的低毒性作用。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，HMME一旦結(jié)合激光照射就會展現(xiàn)其高效的殺傷效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞死亡率達(dá)90%以上。PDT有三個重要元素，光輸出功率、照射時間和光敏劑濃度，前兩者的乘積可表示為光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)中MGC-803細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制，與光動力因子B密切相關(guān)，光動力因子B=光輸出功率×照射時間×HMME濃度（B=I0×t×C）。隨著B值在20 W·mg/L·min范圍內(nèi)增加，存活細(xì)胞明顯減少，總趨勢呈指數(shù)衰減曲線。當(dāng)B值達(dá)到30 W·mg/L·min時，細(xì)胞存活率幾乎達(dá)到最小值。從擬合曲線可以看出，只要B值保持恒定，通過調(diào)節(jié)光強(qiáng)度或HMME濃度值，均可達(dá)到幾乎相同的細(xì)胞殺傷效果。臨床上，對于合并肝腎功能不全的患者，在確保相同治療效果的情況下，可以適當(dāng)降低HMME的濃度，增加光強(qiáng)度即通過增加曝光時間或輸出功率，可最大程度地降低肝腎損害。與其他腫瘤不同，胃腸道腫瘤通常需要內(nèi)窺鏡裝置來引導(dǎo)PDT進(jìn)入消化道，因此曝光時間也應(yīng)該考慮在內(nèi)，對于不能反復(fù)進(jìn)行內(nèi)窺鏡檢查或長時間治療的患者，需要縮短接觸時間或降低治療頻率，通過增加HMME濃度或光輸出功率以確保最佳治療，同時使得其他器官受損最小化。

綜上，HMME介導(dǎo)的PDT是抑制MGC-803細(xì)胞增值的有效方法，光動力因子B與細(xì)胞存活率之間的關(guān)系曲線可指導(dǎo)PDT的臨床應(yīng)用，但還需進(jìn)一步實(shí)踐評估其作用價(jià)值。