楊錦熒 樓袁美 葛彥志 陳祖祥 單樂天 陸海山 賈明

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）是以膝內(nèi)側(cè)疼痛、行走活動(dòng)時(shí)膝痛加重、活動(dòng)受限、關(guān)節(jié)畸形等為主要表現(xiàn)，并伴有軟骨損傷、骨贅形成等臨床癥狀的常見骨科疾?。?］。流行病學(xué)顯示，55歲以上人群中約60%有KOA表現(xiàn)，65歲以上老年人KOA的發(fā)病率可達(dá)85%［2］。脂肪基質(zhì)血管組分（SVF）是從脂肪組織中去除成熟脂肪細(xì)胞后剩余的水相組分，含有多種具有修復(fù)功能的細(xì)胞以及細(xì)胞因子，包括脂肪源性干細(xì)胞（ADSCs）、內(nèi)皮祖細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、周細(xì)胞、造血干細(xì)胞和脂肪前體細(xì)胞等［3］。其中，ADSCs是SVF的重要組成部分，具有多向分化潛能，有較強(qiáng)的血管再生能力、免疫調(diào)節(jié)能力、抗炎能力、成骨和軟骨形成能力［4-5］，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。已有研究證明活體關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射SVF輔助治療KOA，能促進(jìn)軟骨增生，起到修復(fù)和治療KOA的作用［6］。本研究通過觀察不同濃度的SVF干預(yù)KOA大鼠疼痛模型，探討其對(duì)KOA關(guān)節(jié)疼痛和軟骨退變的治療效果，為臨床SVF的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)SD大鼠25只，體質(zhì)量（200±20）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCKK（滬）2007-0005，于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案通過醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑及儀器 胎牛血清（FBS）、磷酸緩沖溶液（PBS）、Ⅱ型膠原酶、生理鹽水、碘乙酸（美國Sigma公司）、手術(shù)剪刀、注射針、戊巴比妥鈉、10%水合氯醛、4%多聚甲醛溶液、EDTA脫鈣液（中國Solarbio公司）、YLS-3E電子壓痛儀（安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 （1）SVF制備及質(zhì)量控制：利用膠原酶消化法制備SVF［7］。將5只SD大鼠處死后，無菌條件下取雙側(cè)腹股溝脂肪組織，PBS清洗3次，去除肉眼可見的筋膜后剪碎，加5倍體積0.2%的Ⅱ型膠原酶于37 ℃恒溫箱內(nèi)磁力攪拌50～60 min，適量10% FBS終止消化，離心，棄上清液，PBS清洗，重復(fù)3次。最后離心所得沉淀物即為SVF，用PBS配成低（1.6×104個(gè) /mL）、中（3.2×104個(gè) /mL）、高（6.4×104個(gè)/mL）三個(gè)濃度，低溫保存?zhèn)溆谩＃?）大鼠分組、造模及干預(yù)：將25只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、SVF低濃度組、SVF中濃度組、SVF高濃度組，每組各5只。模型組、SVF低濃度組、SVF中濃度組和SVF高濃度組大鼠的雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)各注射20 mg/ml碘乙酸50 μl復(fù)制KOA模型，正常組大鼠注射等量生理鹽水。1周后分別向SVF低、中、高濃度組大鼠雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)腔各注射50 μl低、中、高濃度SVF，正常組和模型組大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔注射等量生理鹽水，1次/周，連續(xù)4次。（3）壓痛閾值測(cè)定：使用YLS-3E電子壓痛儀檢測(cè)大鼠的壓痛閾值。將大鼠放置于固鼠籠中，用扁型頭對(duì)大鼠雙側(cè)后足背近節(jié)趾骨底連線進(jìn)行施壓，當(dāng)大鼠因壓痛而出現(xiàn)嘶叫或掙扎時(shí)顯示的壓力值為大鼠的壓痛閾值。實(shí)驗(yàn)開始前先測(cè)定基礎(chǔ)閾值，再分別于模型復(fù)制后第2、4周檢測(cè)痛閾。（4）膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)觀察：最后1次痛閾測(cè)試結(jié)束后，10%水合氯醛麻醉處死大鼠并取5組大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)于4%多聚甲醛固定48 h，用EDTA脫鈣8周，酒精逐級(jí)脫水，石蠟包埋后用切片機(jī)將脛骨外側(cè)和股骨外側(cè)髁軟骨下骨松質(zhì)沿下肢縱軸方向切片，切片厚度為5 μm。切片樣本進(jìn)行常規(guī)脫蠟復(fù)水，經(jīng)清水沖洗后進(jìn)行HE染色和SO染色、封片。光鏡下觀察組織的病理學(xué)改變，并按照OARSI軟骨組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［8］進(jìn)行評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用DPS 9.5更新版統(tǒng)計(jì)軟件。以（）表示。5組大鼠的痛閾值檢測(cè)和OARSI評(píng)分均使用單因素方差分析，再采用LSD比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組壓痛閾值檢測(cè)結(jié)果比較 模型復(fù)制后第2周，模型組和SVF低、中、高濃度組的壓痛閾值相較于正常組均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；模型組和SVF低、中、高濃度組之間壓痛閾值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型復(fù)制后第4周，模型組的壓痛閾值低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SVF低、中、高濃度組的壓痛閾值與模型組比較均顯著提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SVF高濃度組的壓痛閾值高于SVF低濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 1。

圖1 各組壓痛閾值檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 五組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織SO染色病理結(jié)果比較 與正常組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表層纖維化明顯，軟骨層明顯變薄，軟骨細(xì)胞重度肥大且嚴(yán)重丟失，軟骨下骨呈現(xiàn)纖維化退變。低、中、高濃度的SVF對(duì)KOA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨均有改善作用，其中SVF低濃度組軟骨表面部分缺損，軟骨層輕度變薄，少量軟骨細(xì)胞輕度肥大，軟骨下骨輕度纖維化退變；SVF中濃度組軟骨表層纖維化，軟骨層變薄，軟骨細(xì)胞部分丟失，輕度軟骨細(xì)胞肥大；SVF高濃度組軟骨表層纖維化，軟骨層變薄，軟骨細(xì)胞部分丟失，軟骨細(xì)胞中度肥大。見圖2。

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織SO染色病理結(jié)果

2.3 五組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色病理結(jié)果比較 與正常組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面缺損明顯，缺損處軟骨細(xì)胞丟失嚴(yán)重，有大量重度肥大的軟骨細(xì)胞，軟骨下骨呈現(xiàn)纖維化退變。SVF低、中、高濃度組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨與模型組比較，軟骨形態(tài)明顯改善。SVF低濃度組可見軟骨表面輕度缺失，軟骨細(xì)胞部分丟失，可見軟骨細(xì)胞輕度肥大，軟骨下骨部分纖維化；SVF中濃度組可見軟骨表面平整，部分軟骨細(xì)胞丟失，少量軟骨細(xì)胞輕度肥大，軟骨下骨纖維化；SVF高濃度組可見軟骨表面平整，大量軟骨細(xì)胞存活，少量軟骨細(xì)胞肥大，部分軟骨下骨纖維化。見圖3。

2.4 五組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨OARSI評(píng)分比較 模型組OARSI評(píng)分明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SVF低、中、高濃度組的OARSI評(píng)分與模型組相較均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但SVF低、中、高濃度組之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 3。

圖3 五組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色病理結(jié)果和OARSI評(píng)分

3 討論

KOA起病于關(guān)節(jié)軟骨，關(guān)節(jié)軟骨缺乏血管和神經(jīng)的支配，再生和自我修復(fù)能力有限，損傷后難以自我修復(fù)，繼而逐漸侵蝕至軟骨下骨及周圍組織，從而引發(fā)膝關(guān)節(jié)部位疼痛不適、活動(dòng)障礙和畸形［9-10］。SVF來源于脂肪組織，含有多種具有修復(fù)功能的細(xì)胞以及細(xì)胞因子，其中的主要成分ADSCs可分化為軟骨細(xì)胞，促進(jìn)軟骨修復(fù)，有效抑制骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展［11-12］，此外，SVF中所含的細(xì)胞外基質(zhì)具有支持營養(yǎng)作用，可加快組織重塑［13-14］。與ADSCs相較，SVF同樣具有分化軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的能力，且所含成分更多，擁有更強(qiáng)的治療能力，去除脂肪組織中的成熟脂肪細(xì)胞即制備得到，在手術(shù)室便可完成，不需體外擴(kuò)增，節(jié)省體外擴(kuò)增時(shí)間，并避免了體外培養(yǎng)帶來的污染等問題［15］，因此SVF相較于ADSCs在治療KOA方面有著一定優(yōu)勢(shì)。

碘乙酸主要是通過破壞關(guān)節(jié)軟骨和周圍滑膜韌帶，改變關(guān)節(jié)腔原有的穩(wěn)態(tài)［16］，引起軟骨基質(zhì)的退行性改變、軟骨細(xì)胞的破壞凋亡、滑膜炎性改變等造成KOA 模型［17］。POMONIS等［18］用碘乙酸復(fù)制 KOA 動(dòng)物模型，認(rèn)為碘乙酸與KOA疼痛相關(guān)，碘乙酸誘發(fā)的大鼠KOA具有較好的均一性和可比性。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs關(guān)節(jié)腔注射給藥每周一次，持續(xù)4周，能修復(fù)受損的關(guān)節(jié)軟骨，恢復(fù)關(guān)節(jié)功能［19］。每周關(guān)節(jié)腔注射給藥一次，持續(xù)4周能達(dá)到較好的治療效果，故作為關(guān)節(jié)腔給藥的常用頻次。

本研究疼痛閾值檢測(cè)結(jié)果表明，SVF可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)，并有效提高KOA疼痛閾值，低濃度的SVF就可以達(dá)到良好的效果，且治療效果與治療濃度呈一定程度的正相關(guān)。關(guān)節(jié)組織病理結(jié)果表明，關(guān)節(jié)腔注射SVF具有減輕關(guān)節(jié)疼痛，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨增殖修復(fù)等作用。實(shí)驗(yàn)中沒有明顯不良反應(yīng)的發(fā)生，證明了SVF治療的有效性和安全性。本研究主要不足之處為尚處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，對(duì)SVF緩解疼痛、促進(jìn)軟骨細(xì)胞再生和（或）軟骨祖細(xì)胞原位再生、受損關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)過程和具體機(jī)制尚不清楚。KOA的發(fā)生發(fā)展受多種因素影響，SVF不僅能夠預(yù)防、治療KOA，還可以阻止受損關(guān)節(jié)的進(jìn)一步發(fā)展，甚至逆轉(zhuǎn)KOA的發(fā)病機(jī)制，使之恢復(fù)正常，仍需要大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床探索研究驗(yàn)證。

綜上，SVF能有效緩解KOA疼痛，促進(jìn)關(guān)節(jié)修復(fù)，低劑量就能有明顯效果，具有獲取方便、低劑量、安全、有效等優(yōu)點(diǎn)，有進(jìn)一步深入研究的潛在價(jià)值。