崔 翔 邢宇鋒 何堂清 姜小艷 盛國光△

1.安康市中醫(yī)醫(yī)院肝病科 (陜西 安康， 725000) 2.深圳市中醫(yī)院暨廣州中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院肝病科 3.湖北省中醫(yī)醫(yī)院肝病科

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種與胰島素抵抗(IR)和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝臟損傷，其疾病譜包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝細胞癌(HCC)。NAFLD是常見的慢性肝病，普通成人中NAFLD患病率介于6.3%～45%，其中10%～30%為NASH[1]，且發(fā)病年齡有低齡化趨勢，嚴重危害人類身心健康，是目前全世界范圍內(nèi)面臨的公共健康問題之一。近10余年來，隨著腸道微生態(tài)學研究的快速進展及對“腸-肝”軸生理病理認識的深入，發(fā)現(xiàn)NAFLD的發(fā)病機制與腸道微生態(tài)環(huán)境紊亂密切相關?；诖?，有學者提出了“多重打擊學說”[2]，其主要觀點包括腸道菌群失調及與之相關的內(nèi)毒素血癥、代謝性炎癥學說。NASH是NAFLD病程進展中最為關鍵的階段，需要在改善生活方式的基礎上及時進行藥物干預。本研究采用高脂飲食誘導的NASH大鼠模型,應用雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌干預，觀察其對NASH模型大鼠的防治作用，并重點探討其對代謝性炎癥的影響，以期為益生菌防治NASH提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級6周齡雄性SD大鼠32只[動物許可證號:SCXK(鄂)2015-0018]，體重180～200 g，購自湖北省實驗動物研究中心。自由進食、飲水，喂標準顆粒飼料，室溫18～22℃，相對濕度55%，采用標準化光照。

1.2 動物飼料

1.2.1 標準飼料 主要營養(yǎng)成分指標：水分≤10%，鈣1.0%～1.8%，磷0.6%～1.2%，鈣磷比：1.2∶1，粗脂肪≥4%，粗纖維≤5%，賴氨酸≥8.2%，粗灰分≤8%，蛋氨酸≥0.53%，粗蛋白≥18%。

1.2.2 高脂飼料 由標飼料按比列加工配制而成。其中糖∶脂肪∶蛋白供能比例為33%∶50%∶17%。成份構成：普通詞料60%，豬油22%，蔗糖6%，酪蛋白5%，玉米蛋白粉3%，膽固醇2%，磷酸鈣1.6%，添加劑0.4%。由武漢萬千佳興生物科技有限公司按照配方加工而成。

1.3 藥物 雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片(內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份集團有限公司生產(chǎn)，批號：130318，規(guī)格：0.5 g/粒)。采用0.9%氯化鈉溶液溶解配成100 mg/ml的溶液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 主要試劑及儀器 游離脂肪酸(FFA)測試盒(A042，南京建成生物工程研究所)、甘油三酯(TG)測試盒(A110-2，南京建成生物工程研究所)。Rat IL-1βELISA Kit(RA20020，Bioswamp)；Rat TNF-a ELISA Kit(RA20035，Bioswamp)，鱟試劑盒(140325，廈門鱟試劑有限公司)。7170全自動生化分析儀(日本日立公司)；Multiskan MK3全自動酶標儀(Thermo scientific)；752紫外分光光度計(上海舜宇恒儀器有限公司)。

1.5 動物分組與造模干預 32只雄性SD大鼠，稱重后按隨機數(shù)字表法隨機分為3組，其中正常對照組、益生菌干預組各8只，模型對照組16只。經(jīng)適應性喂養(yǎng)3 d后，模型對照組、益生菌干預組均給予高脂飲食飼養(yǎng)，正常對照組以標準飼料喂養(yǎng)。每4周從模型對照組隨機選取2只大鼠處死以動態(tài)評估模型的復制情況，經(jīng)HE染色證實第4周末模型對照組大鼠復出現(xiàn)肝脂肪變，于實驗第5周開始，益生菌干預組大鼠給以雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片溶液0.7 g·kg-1d-1灌胃，正常對照組和模型對照組大鼠予以等劑量的0.9%氯化鈉溶液灌胃，根據(jù)大鼠體重變化調整給藥劑量，連續(xù)灌胃12周。

1.6 標本采集 實驗第16周，末次給藥后24 h，先稱取各組大鼠體重，記錄一般情況后，采用0.2 g/ml的烏拉坦腹腔注射麻醉，處死后采集分別采集血液、肝臟組織標本，保存待檢。

1.7 檢測指標

1.7.1 血清ALT、AST的檢測 腹主動脈取血后，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，分離血清，按操作步驟，進行ALT、AST檢測。

1.7.2 肝臟勻漿組織TG、FFA的檢測 肝臟標本用0.9%氯化鈉沖洗3次，除去肝臟包膜。剪取同一部位，并準確稱量100 mg肝組織剪碎，用0.9%氯化鈉沖洗至表面無血色為止，然后放入含0.2 ml 0.9%氯化鈉的塑料離心管內(nèi)，搗碎研磨制成10%組織勻漿。向勻漿中加入0.8 ml的氯仿-甲醇(1∶1)抽提液充分混勻。按將制備好的勻漿行離心后按照試劑盒操作進行檢測。

1.7.3 血漿LPS的檢測 在無菌技術下，抽取門靜脈血1 ml，裝入無熱原抗凝管，3 000 r/min，離心3 min，取上清液標本，按照鱟試劑盒說明書操作步驟檢測。

1.7.4 血清IL-1β、TNF-α的檢測 采用雙抗體夾心ELISA法，按試劑盒操作說明書操作步驟測定。

2 結果

2.1 各組大鼠肝臟HE染色情況 見圖1(A-C×200)。經(jīng)HE染色和血清ALT、AST檢測證實于實驗第16周復制成NASH模型。正常對照組大鼠肝小葉結構完整；肝索呈放射狀分布于中央靜脈周圍，整齊排列，肝竇清晰可見；肝細胞大小均勻，核結構清晰，細胞內(nèi)少有脂質沉積。模型對照組肝組織呈重度彌漫性肝細胞大泡性脂肪變性，可見氣球樣變，部分肝小葉內(nèi)有壞死灶，匯管區(qū)可見顯著的炎性細胞浸潤，并向小葉內(nèi)延伸，部分標本有明顯的炎性細胞浸潤。益生菌干預組也可見不同程度彌漫性肝細胞脂肪變及炎癥，但較模型對照組有明顯改善。

圖1 各組大鼠第16周肝臟HE染色(×200)

2.2 各組大鼠血清ALT、AST的比較 見表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST情況的比較 (U/L)

2.3 肝臟組織勻漿TG、FFA含量比較 與正常對照組比較，2個高脂造模組大鼠肝臟勻漿TG、FFA水平明顯升高(P<0.01或P<0.05)。與模型對照組相比，益生菌干預組大鼠肝臟勻漿TG、FFA水平均顯著降低(P<0.01或P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肝臟勻漿TG、FFA濃度的比較

2.4 各組小鼠血漿LPS水平的比較 相對正常對照組，模型對照組和益生菌干預組血漿LPS均顯著升高(P<0.05)，而與模型對照組比較，益生菌干預后可明顯降低血漿LPS的水平(P<0.05)，見表3。

2.5 各組小鼠血清IL-1β、TNF-α水平的比較 與正常對照組比較，模型組和益生菌組血清TNF-α、IL-6的水平均升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，益生菌干預組IL-1β(P<0.05)，和TNF-α(P<0.05)水平較模型組顯著降低， 見表3。

表3 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α和血漿LPS水平的比較

3 討論

針對NAFLD的治療，最新的國內(nèi)外指南推薦意見中尚無療效顯著且安全的藥物，目前臨床常用的藥物包括胰島素增敏劑、保肝藥物、調節(jié)血脂藥、抗氧化劑等[3]。

由于IR是NAFLD發(fā)生發(fā)展的主要機制之一，改善IR是治療NAFLD的關鍵之一，二甲雙呱是臨床中最常用胰島素增敏劑之一，近期研究證據(jù)顯示其改善IR的作用機理與調節(jié)腸道菌群密切相關[4-6]。2015年由哈佛大學、耶魯大學聯(lián)合發(fā)布的《益生菌應用建議:進展與共識(更新版)》首次增加了VSL#3、LGG等益生菌在成人和兒童NAFLD患者中的應用推薦[7]。因此，可以預見腸道靶向微生態(tài)調節(jié)劑將是未來NAFLD的防治的重要策略之一[8]。雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片包含長型雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌3種活性成分，是臨床上最常用且安全、經(jīng)濟的腸道益生菌組合。本研究采用高脂飼料于第4周末復制成SD雄性大鼠非酒精性脂肪變模型，歷時16周成功誘發(fā)NASH模型，經(jīng)檢測證實其病理和轉氨酶改變亦符合人類NASH的臨床診斷標準[9]。于實驗第5周開始給予雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片干預觀察其對NASH的防治效果。研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片干預組大鼠血清中ALT、AST水平、肝臟勻漿TG、FFA的含量明顯低于模型對照組，表明雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片可降低模型大鼠升高的血清轉氨酶、改善肝臟脂質代謝紊亂，對高脂飼料誘發(fā)的NASH模型大鼠的疾病進展確有一定的防治效果。

“腸-肝軸”構成了腸-肝之間生理聯(lián)系的基礎，而脂多糖(LPS)則是溝通腸-肝損傷的病理中介。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁外層的主要成分，也是循環(huán)內(nèi)毒素的主要成分，來源于腸道的LPS，經(jīng)由門靜脈進入到肝臟，當超過肝臟的代謝能力，即形成代謝性內(nèi)毒素血癥。LPS不僅可以直接造成肝臟損害，而且可以誘導機體產(chǎn)生大量TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子及炎癥介質的表達，引起代謝性炎癥，進一步加重肝臟及其他組織、靶器官的損傷。近年來提出的“代謝性炎癥”的概念認為，營養(yǎng)代謝性因素導致的腸道菌群失調產(chǎn)生的毒素進入血液，可以引起全身長期系統(tǒng)性、低水平的慢性炎癥，而這種炎癥缺乏傳統(tǒng)意義上炎癥“紅、腫、熱、痛”的典型表現(xiàn)，可以導致包括NAFLD、肥胖、2型糖尿病、動脈粥樣硬化、胰島素抵抗等在內(nèi)的營養(yǎng)代謝性疾病的發(fā)生[10,11]?；诖耍瑖鴥?nèi)學者首次提出“代謝性炎癥綜合征(MIS)”的概念及診斷思路，建議將伴有2個及以上代謝性疾病的患者整合定義為MIS[12,13]。本研究發(fā)現(xiàn)高脂飼料誘發(fā)的NASH模型大鼠血漿LPS和血清炎癥因子IL-1β、TNF-α水平顯著升高，證實模型大鼠體內(nèi)存在內(nèi)毒素血癥和代謝性炎癥，經(jīng)雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌干預組后大鼠門靜脈血漿中LPS水平、血清炎癥因子IL-1β、TNF-α水平亦相應下降，證實雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片在一定程度上可以改善NASH模型大鼠的代謝性炎癥。

綜上，本研究表明雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌可以改善高脂誘發(fā)的NASH模型大鼠的肝功能和脂質代謝，對大鼠的NASH有確切的防治效果，其作用機制可能與其調節(jié)NASH模型大鼠腸道菌群，改善內(nèi)毒素血癥、代謝性炎癥密切相關，其對NASH模型大鼠腸黏膜微生態(tài)屏障影響的詳細機制研究有待進一步深入。