李春青 過建春 荀運(yùn)浩 王薇薇 石偉珍

杭州市西溪醫(yī)院 (浙江 杭州， 310023)

在我國慢加急性肝衰竭多由慢性乙型病毒性肝炎或肝硬化發(fā)展而來，臨床治療難度大，病死率高，嚴(yán)重危害人類健康。根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“黃疸”、“瘟黃”、“急黃”范疇。綜觀各醫(yī)家文獻(xiàn)，本病病機(jī)復(fù)雜，但總不外“瘀、毒、濕、熱”諸端。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)慢加急性肝衰竭中醫(yī)證型主要以“瘀熱、濕熱”為主[1]。近年來腸道菌群失調(diào)、腸黏膜屏障功能受損在肝衰竭發(fā)病過程中備受關(guān)注。慢性重型肝炎患者存在嚴(yán)重腸道微生態(tài)改變[2,3]，腸道菌群可能在慢加急性肝衰竭患者的病情發(fā)展中起著非常重要的作用。因此本研究通過16S rRNA測序技術(shù)明確腸道菌群在濕熱瘀黃證慢加急性肝衰竭患者中的分布特征及腸道菌群結(jié)構(gòu)，初步探討腸道菌群分布特征與其預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6月至2019年8月在我院住院的濕熱瘀黃證慢加急性肝衰竭患者37例，均符合納入標(biāo)準(zhǔn)，患者入組前簽署知情同意書，研究方案經(jīng)杭州市西溪醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，獲得患者知情同意后留取大便標(biāo)本。所有患者在采樣前2周內(nèi)均未接受過抗生素治療，其中男28例，女9例，年齡20～64歲，平均(51.28±11.32)歲。對入組患者隨訪24周，24周時好轉(zhuǎn)組患者24例，男20例，女4例，平均年齡(50.79±11.21)歲；無好轉(zhuǎn)組患者13例，男8例，女5例，平均年齡(52.08±11.93)歲。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) ①西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)：慢加急性肝衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2015年《慢性乙型肝炎防治指南》及2012年《肝衰竭診療指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4，5]。②中醫(yī)濕熱瘀黃證辨證標(biāo)準(zhǔn)。主癥：a.起病急驟，身目俱黃，尿黃不利或自利；b.皮膚瘙癢，胃脘痞滿，或口苦泛惡；c.舌苔黃膩或舌質(zhì)紫暗、有瘀斑瘀點(diǎn)，舌下脈絡(luò)增粗延長。次癥：a.口渴但飲水不多；b.大便不調(diào)或秘結(jié)；c.鼻齒衄血，或皮膚瘀斑；d.脅下痞塊；e.少苔或舌苔薄白或薄黃，脈弦或弦滑或弦數(shù)。辨證要求：凡具備主癥3項，或主癥2項加次癥2項，脈象基本符合，可定為本證。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①同時符合西醫(yī)及中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者；②自愿參加本研究并簽署知情同意書者；③年齡16～65歲。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①急性肝衰竭、慢性肝衰竭患者；②其他病因(包括自身免疫性、藥物性、酒精性、中毒性、寄生蟲性)導(dǎo)致的慢加急性(亞急性)肝衰竭患者；③原發(fā)性肝癌患者；④抗HIV陽性者，合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒或巨細(xì)胞病毒、EB病毒等其他嗜肝病毒感染者；⑤入組時即合并中度腦水腫、嚴(yán)重感染(包括感染性休克、深部真菌感染、2部位以上感染、二重感染等)、Ⅰ型肝腎綜合征、消化道大出血等患者；⑥采樣前2周內(nèi)使用生素或微生態(tài)調(diào)節(jié)劑患者；⑦膽囊切除或消化道手術(shù)史、脾切除史患者；合并有心、腦、腎、血液系統(tǒng)等臟器功能嚴(yán)重?fù)p傷者及精神病患者；⑧妊娠或哺乳期婦女；⑨不愿合作及依從性差的患者。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 臨床指標(biāo)及治療觀察 對所有入組患者檢測肝功能、凝血功能、乙肝三系、血氨、腹部超聲等，依據(jù)臨床經(jīng)驗及指南等進(jìn)行規(guī)范化治療，并觀察至24周。

1.5.2 預(yù)后判斷及分組方法 以入組24周時狀況或死亡為終點(diǎn)進(jìn)行分組。好轉(zhuǎn)組：①臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn)，肝性腦病消失；②黃疸、腹水等體征明顯好轉(zhuǎn)；③肝功能指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)(TBil降至正常的5倍以下，PTA>40%)；其他均歸為無好轉(zhuǎn)組。

1.6 標(biāo)本采集及檢測 收集入組患者的糞便，置于-80℃冰箱中保存，統(tǒng)一提取樣本DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA完整性，Nanodrop 2000檢測基因組DNA質(zhì)量，對于合格的樣本檢測區(qū)域進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增，利用帶有Index序列的引物，通過高保真PCR向文庫末端引入特異性標(biāo)簽序列。擴(kuò)增后產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測，應(yīng)用核酸純化磁珠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到一個樣本的原始文庫。對已經(jīng)帶有各自Index標(biāo)簽的樣本文庫濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋，后利用Qubit對文庫進(jìn)行精確定量，根據(jù)不同樣本的測序通量要求，按相應(yīng)比例(摩爾比)混合樣本，通過Agilent 2100 Bioanalyzer檢測測序文庫插入片段的大小，確認(rèn)在120～200 bp之間無非特異性擴(kuò)增，并準(zhǔn)確定量測序文庫濃度，采用Miseq平臺，2×250 bp的雙端測序策略對文庫進(jìn)行測序，后續(xù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.7 生物信息學(xué)分析 采用 Mothur、R對可操作分類單元(OTUs)進(jìn)行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。組間樣品菌群差異性分析采用Lefse方法，LDA score(log 10)>2的物種被認(rèn)為具有顯著性差異。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析,對分組樣本的群落結(jié)構(gòu)以及物種組成進(jìn)行差異顯著性檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 群落組成分析

2.1.1 多樣本物種組成柱狀圖 在門的水平上，厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes) 為優(yōu)勢菌群，另外豐度較高的菌群還有變形菌門(Proteobacteria)，放線菌門 (Actinobacteria)。門水平下兩組樣本腸道菌群的組成情況見圖1。在屬的水平上(圖2)豐度較高的為擬桿菌屬(Bacteroides)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、大腸桿菌志賀菌(Escherichia/Shigella)、韋榮氏球菌屬(Veillonella)、普雷沃菌屬(Prevotella)。

圖1 在門水平上的菌群相對分布情況柱形圖

圖2 在屬水平上的菌群相對分布情況柱形圖

2.1.2 Metastats分析 通過Metastats分析對組間樣本進(jìn)行比較，在各分類水平上找出兩組中具有顯著差異的物種，以P<0.05作為差異顯著性篩選閾值，對于組間豐度顯著差異的物種繪制箱體圖，見表3、表4。

2.2 Alpha多樣性分析 多樣性指數(shù)差異分析：基于各樣本的多樣性指數(shù)，可以檢驗組間樣本的Alpha多樣性是否存在顯著差異?；赪ilcoxon秩和檢驗對組間多樣性指數(shù)進(jìn)行差異分析，以P<0.05作為差異顯著性篩選閾值，并使用 Bonferroni方法對P值進(jìn)行多重假設(shè)檢驗校正，用以評估組間物種多樣性是否存在顯著差異。Alpha多樣性分析表明，兩組的Chao1指數(shù)(P=0.718)、Ace 指數(shù)(P=1)、Shannon指數(shù)(P=0.987)和Simpson指數(shù)(P=0.913)均沒有統(tǒng)計學(xué)差異。好轉(zhuǎn)組和無好轉(zhuǎn)組患者的腸道菌群Alpha多樣性沒有明顯差異。

2.3 Beta多樣性分析

2.3.1 Venn圖 基于OTU豐度表,以分組為單位,Venn圖可以篩選每組樣本中特有的OTU，以及組間共有的OTU[6]，并進(jìn)行可視化展示。由圖5可以看出，慢加急性肝衰竭好轉(zhuǎn)組患者腸道菌群OTU為1 156種，而無好轉(zhuǎn)組患者腸道菌群OTU為905種，好轉(zhuǎn)組患者腸道菌群物種數(shù)量多于無好轉(zhuǎn)組。

圖3 在門、綱、屬水平上差異物種比較箱圖

圖4 在目、科水平上差異物種比較箱圖

圖5 兩組患者的腸道菌群間共有與特有的OUT

2.3.2 Lefse分析 Lefse分析可用于篩選最可能解釋組間差異的物種 在以上分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的Lefse分析顯示了兩組腸道菌群在各個物種層次的特性分布差異(圖6)?？梢钥闯鰞山M間樣品腸道菌群在多個分類學(xué)水平都有比較大的差異。根據(jù)LAD SCORE大小，好轉(zhuǎn)組患者糞便微生物群落優(yōu)勢菌群有普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、干酪乳桿菌Zhang (Lactobacillus Casei Zhang)、梭狀桿菌(Clostridium)，Pseudoflavonifractor、羅斯氏菌屬(Roseburia)等，而無好轉(zhuǎn)組患者中鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)、異單胞菌科(Alteromonadaceae)、假交替單胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)、腸桿菌科(enterobacteriaceae)、嗜鹽單胞菌科(Halomonadaceae)、海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)的相對菌群豐度高于好轉(zhuǎn)組(P<0.05)。

圖6 好轉(zhuǎn)組和無好轉(zhuǎn)組患者腸道菌群Lefse分析

3 討論

腸道微生態(tài)系統(tǒng)是人體最大的微生態(tài)系統(tǒng)，由3個部分組成：腸道菌群、腸上皮細(xì)胞、腸道黏膜免疫系統(tǒng)[7]。腸道菌群構(gòu)成復(fù)雜，細(xì)菌種類繁多，其菌種達(dá)到1 000多種，總數(shù)達(dá)100萬億，是人體自身細(xì)胞總數(shù)的10倍[8]。腸道微生物相互依存、制約，在維持人體營養(yǎng)、代謝、免疫、防御、腸道微生態(tài)平衡等方面發(fā)揮著重要作用，越來越多的研究表明腸道菌群與人類疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。Round等[9]發(fā)現(xiàn)疾病狀態(tài)下會導(dǎo)致腸道中共生的細(xì)菌數(shù)量減少，而致病菌的數(shù)量會增加，腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變在另一方面又會加重病情進(jìn)展，由于對腸-肝軸認(rèn)識的逐步深入，腸道細(xì)菌易位、免疫功能障礙和肝臟炎癥反應(yīng)是慢加急性肝衰竭的主要發(fā)病機(jī)制[10]，腸道菌群失調(diào)在肝衰竭發(fā)病過程中起著重要作用。慢加急性肝衰竭病情重，并發(fā)癥多，病死率高，準(zhǔn)確判斷病情的預(yù)后對臨床選擇治療手段尤為重要，但慢加急性肝衰竭患者的腸道菌群特征與其預(yù)后關(guān)系的相關(guān)研究較少。

我們前期的研究顯示，濕熱瘀黃證是慢加急性肝衰竭的主要證型，本研究主要分析濕熱瘀黃證慢加急性肝衰竭患者腸道菌群特征。通過16S r DNA基因檢測分析得出，在門分類水平上，患者腸道菌群以厚壁菌門和擬桿菌門兩個優(yōu)勢菌群為主，這與近年來的相關(guān)研究結(jié)果相符[11，12]。雖然本研究中兩組間腸道菌群Alpha多樣性沒有明顯差異，但是相對于好轉(zhuǎn)組，無好轉(zhuǎn)組患者腸道菌群物種數(shù)減少，慢加急性肝衰竭患者無好轉(zhuǎn)組菌群的改變還表現(xiàn)在其組成結(jié)構(gòu)上的差異。在門水平上，在腸道中占有重要作用的優(yōu)勢菌厚壁菌門所占的比例顯著減少，然而變形菌門所占的比例卻明顯增多。已有研究發(fā)現(xiàn)[13]，在肝衰竭患者的腸道內(nèi)都有低厚壁菌門的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)好轉(zhuǎn)組患者厚壁菌門相對豐度顯著高于無好轉(zhuǎn)組，厚壁菌門含量減少可能與慢加急性肝衰竭患者的病情加重有關(guān)。另外在屬水平上好轉(zhuǎn)組患者十八梭菌屬相對豐度高于無好轉(zhuǎn)組，國內(nèi)有小樣本的研究顯示肝衰竭患者腸道內(nèi)梭桿菌屬消失[14]，具體原因尚不明確。

在研究中我們還發(fā)現(xiàn)好轉(zhuǎn)組患者巴斯德菌科相對豐度高于無好轉(zhuǎn)組，Chen等[15]的研究中發(fā)現(xiàn)特定的細(xì)菌與慢加急性肝衰竭的炎癥因子相關(guān)，巴斯德菌科與MELD指數(shù)相關(guān)，能獨(dú)立預(yù)測患者的預(yù)后，提示腸道菌群失調(diào)與慢加急性肝衰竭的死亡率相關(guān)。另一項研究顯示肝硬化失代償和發(fā)生慢加急性肝衰竭且死亡的患者存在更為嚴(yán)重的腸道菌群紊亂，說明腸道菌群在慢加急性肝衰竭中的意義[16]。Li等[17]的研究也顯示慢性重型肝炎患者腸道微生態(tài)嚴(yán)重失衡，腸道微生態(tài)失衡程度與肝炎病情嚴(yán)重程度有關(guān)，由此可以看出慢加急性肝衰竭病情進(jìn)展與其腸道菌群有著密切聯(lián)系，腸道菌群在預(yù)測病情轉(zhuǎn)歸及預(yù)后方面有著重要的價值。

慢加急性肝衰竭患者腸道菌群失調(diào)主要是菌群的整體多樣性與豐度明顯減少[18]，且腸道菌群失調(diào)是病情加重的重要因素，因此，改善腸道菌群失調(diào)有助于延緩或防止肝衰竭進(jìn)展。具有高多樣性的腸道菌群可能對病情的恢復(fù)極其有意義，而低多樣性的腸道菌群可能會促進(jìn)慢加急性肝衰竭病情的進(jìn)展。因此當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)時及時調(diào)整腸道菌群，維持其平衡與穩(wěn)定狀態(tài)對病情的好轉(zhuǎn)有著重要的作用。

腸道微生物在肝衰竭的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，通過分析各組糞便的物種豐度、物種多樣性的增減，菌群結(jié)構(gòu)的變化，深入肝衰竭腸道微生態(tài)的研究，闡明肝衰竭預(yù)后與腸道菌群特征的關(guān)系，有助于盡早發(fā)現(xiàn)疾病發(fā)展趨勢。本研究初步探討了腸道菌群在預(yù)測慢加急性肝衰竭患者預(yù)后中的價值，但由于客觀原因我們僅研究了濕熱瘀黃證慢加急性肝衰竭患者，且入組患者偏少，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多證型間的橫向比較分析。明確肝衰竭發(fā)展趨勢及預(yù)后有助于選擇適當(dāng)?shù)闹委煼椒ǚ乐共∏檫M(jìn)展，今后應(yīng)深入研究腸道菌群及其代謝產(chǎn)物在肝衰竭發(fā)病中的作用機(jī)制，開展研究以腸道菌群為靶點(diǎn)的治療方法的安全性和有效性，為慢加急性肝衰竭的防治提供可靠依據(jù)。