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        尼古丁作用下牙周膜細(xì)胞c-Fos通路表達(dá)變化的相關(guān)研究

        2021-07-20 12:10:30陳靜濤周志斐李保東陳新釗衛(wèi)克文
        空軍航空醫(yī)學(xué) 2021年2期
        關(guān)鍵詞:牙周膜尼古丁牙周組織

        陳靜濤,周志斐,王 燕,宋 薇,李保東,陳新釗,衛(wèi)克文

        牙周炎為口腔兩大常見病之一,是由于細(xì)菌感染導(dǎo)致牙周組織出現(xiàn)慢性感染性炎癥的一種疾病。其典型癥狀為牙槽骨吸收,牙齒松動脫落等。吸煙是牙周炎的重要影響因素,吸煙者牙周炎患病率高,病情重,治療效果及預(yù)后較差[1]。煙草中的尼古丁被證實(shí)在牙周組織的破壞過程中發(fā)揮重要作用。Kim等[2]證實(shí)尼古丁通過結(jié)合牙周膜干細(xì)胞上的煙堿型乙酰膽酰受體α7亞型(α7 acetylcholine receptor,α7 nAChR),加快牙周膜干細(xì)胞凋亡,降低牙周組織修復(fù)速度,且該現(xiàn)象存在濃度依賴性。課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),大鼠和人類的牙周組織中存在α7 nAChR的功能性表達(dá),尼古丁通過α7 nAChR在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的破壞性效應(yīng)可被受體特異性拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素(α-BTX)所部分抑制[3]。然而尼古丁和α7 nAChR結(jié)合后下游究竟是通過何種途徑造成牙周破壞,具體機(jī)制仍不清楚。c-Fos是破骨細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵因子,c-Fos基因敲除鼠表現(xiàn)為原發(fā)性脆骨硬化癥,過度表達(dá)c-Fos的轉(zhuǎn)基因鼠可出現(xiàn)軟骨肉瘤等癥狀[4]。c-Fos在破骨細(xì)胞分化過程中是RANKL重要調(diào)控因子,可調(diào)控下游因子促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[5]。Chang等[6]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),尼古丁可促進(jìn)人牙周膜中c-Fos的基因表達(dá),且其效果顯著依賴于細(xì)胞硫醇的水平。為進(jìn)一步研究尼古丁作用于人牙周膜細(xì)胞后的效應(yīng)機(jī)制,本研究檢測了尼古丁作用后細(xì)胞c-Fos與α7 nAChR的相互關(guān)系,旨在探討尼古丁對人牙周膜細(xì)胞的影響,為進(jìn)一步揭示尼古丁參與吸煙相關(guān)性牙周炎的可能功能作用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 主要儀器和試劑 尼古?。╓ako,日本);DMEM培養(yǎng)基(GibcoBRL公司,美國);胎牛血清(云天生物技術(shù)研究所,中國);α-BTX(Santa,美國);c-Fos小鼠抗人IgG單克隆抗體,山羊抗小鼠IgG二抗,RT-PCR試劑盒(Takara,中國);RNA提取試劑盒(Omega,美國);ABI7500實(shí)時定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司,美國);電泳儀,轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad,美國);低溫離心機(jī),微量移液器(Eppendorf,德國)。

        1.2 牙周膜細(xì)胞培養(yǎng) 自空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院門診部口腔科收集健康無齲壞及根尖周感染的第一前磨牙,供體均為12~18歲青少年,牙齒均因正畸治療需要而被拔除。刮取根中1/3段牙周膜組織。滴管轉(zhuǎn)移組織塊及培養(yǎng)液至離心管中,1 000 r pm離心5 min棄上清,加入約1 ml DMEM培養(yǎng)液(含20%胎牛血清)至離心管,將組織塊吹打均勻,用滴管吸出,加入六孔板底,用蓋玻片覆蓋組織塊,置于37 °C恒溫孵箱(5% CO2、濕度100%)培養(yǎng)。當(dāng)孔內(nèi)細(xì)胞長至80%時,PBS沖洗2遍,每孔滴加約1 ml 0.25%的胰蛋白酶,反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液,1 000 rpm離心5 min后加入1 ml DMEM培養(yǎng)液(含20%胎牛血清),吹打均勻以1:3體積比轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶后置于恒溫培養(yǎng)箱。待細(xì)胞數(shù)量約占六孔板底面積80%時再次傳代,5代細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。取第5代人牙周膜細(xì)胞,以2×104個/ml接種于六孔板中,置于37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞鋪滿六孔板底部80%,形態(tài)、密度均達(dá)到良好狀態(tài)時加入含不同濃度尼古丁的培養(yǎng)液(0 M、10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、10-7M)作用不同時間(0、1、2、4、8、24 h),檢測尼古丁作用于人牙周膜細(xì)胞后c-Fos mRNA和蛋白的表達(dá)變化。α-BTX作用濃度為10-8M,隨尼古丁同時加入培養(yǎng)液以觀察其對尼古丁作用的阻斷效應(yīng)。分別以無尼古丁作用和尼古丁作用0 h為空白對照。

        1.3 RNA提取及RT-PCR檢測 不同分組及不同處理細(xì)胞終止實(shí)驗(yàn)后行RT-PCR檢測。采用Omega提取細(xì)胞總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)以10 μl反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于PCR擴(kuò)增。基因擴(kuò)增儀按照預(yù)設(shè)程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及基因擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,72 ℃終延伸2 min,35個循環(huán)。所得PCR產(chǎn)物行凝膠電泳(120 V,25 min)實(shí)驗(yàn),Bio-RadD凝膠定量軟件Quantity One 分析目的基因凝膠電泳結(jié)果,采集圖像。反應(yīng)完成后,采用CFX Manager軟件(Version 2.1)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)算每組樣本Ct值,以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算2-△△Ct值,基于溶解曲線判斷擴(kuò)增產(chǎn)物是否具有特異性。引物由上海生工生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成(β-actin:上游為5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'下游為5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3';c-Fos:上游為5'-CTCCAGTGCCAACTTCATTCC-3';下游為5’-CATCTTATTCCTTTCCCTTCGG-3')。

        1.4 蛋白提取和Western blot檢測 不同分組及不同處理細(xì)胞終止實(shí)驗(yàn)后提取蛋白,各組蛋白濃度利用BCA法進(jìn)行測定,定量后進(jìn)行凝膠電泳,每個泳道中的樣本蛋白含量相同。轉(zhuǎn)移目的蛋白至NC膜上后,封閉,加入c-Fos小鼠抗人IgG單克隆抗體,封膜,過夜孵育;洗膜,封山羊抗小鼠IgG二抗,掃膜;Bio-Rad Quantity One軟件進(jìn)行蛋白條帶定量分析。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,3組及以上的比較采用單因素方差分析(Oneway analysis of variance),對實(shí)驗(yàn)組和對照組檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn),組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 尼古丁作用后c-Fos mRNA變化的時間梯度及濃度梯度實(shí)驗(yàn) PCR結(jié)果提示,10-5M濃度尼古丁作用于牙周膜細(xì)胞1 h后c-Fos mRNA表達(dá)顯著升高(圖1),而隨著作用時間的延長,c-Fos表達(dá)逐漸減低。當(dāng)作用時間限定為1 h時,PCR結(jié)果提示,較之于10-3M濃度,10-4M濃度尼古丁作用于牙周膜細(xì)胞后c-Fos mRNA表達(dá)顯著升高(圖2)。10-5M濃度尼古丁作用下c-Fos表達(dá)逐漸減低(P<0.05)??紤]尼古丁對細(xì)胞的毒性作用,本課題后續(xù)采用10-5M尼古丁作用于人牙周膜細(xì)胞1 h觀察相關(guān)指標(biāo)的改變。

        圖1 尼古丁作用不同時間后人牙周膜細(xì)胞c-Fos mRNA的表達(dá)改變

        圖2 不同濃度尼古丁對人牙周膜細(xì)胞c-Fos mRNA表達(dá)改變的影響

        2.2 尼古丁和/或α-BTX對c-Fos蛋白表達(dá)的影響 Western blot及其半定量檢測結(jié)果提示,10-5M尼古丁作用于人牙周膜細(xì)胞1 h后,細(xì)胞c-Fos蛋白表達(dá)顯著上調(diào),約為空白對照的3倍,加入10-8M α-BTX后,c-Fos蛋白表達(dá)上調(diào)的趨勢得到顯著抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

        圖3 尼古丁對人牙周膜細(xì)胞c-Fos蛋白的影響

        2.3 尼古丁和/或α-BTX對c-FosmRNA表達(dá)的影響 以10-5M尼古丁作用于牙周膜細(xì)胞1 h后,電泳圖顯示:10-5M尼古丁可上調(diào)c-Fos mRNA的表達(dá),而α7 nAChR拮抗劑α-BTX可顯著抑制這一作用,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。單獨(dú)α-BTX作用于牙周膜細(xì)胞后,c-Fos mRNA的表達(dá)并未發(fā)生顯著改變(P>0.05)(圖4)。實(shí)時定量PCR結(jié)果與反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果類似(圖5)。

        圖4 尼古丁對人牙周膜細(xì)胞c-Fos mRNA表達(dá)的影響

        圖5 實(shí)時定量PCR檢測尼古丁對人牙周膜細(xì)胞c-Fos mRNA表達(dá)的影響

        3 討論

        牙周炎發(fā)病率高,愈后較差,是導(dǎo)致成年患者牙列缺損、甚至缺失的主要病因[7]。吸煙是引起牙周炎的高危因素之一。尼古丁是煙草中的主要生物堿,占煙草生物堿總量的95%以上。尼古丁對牙周組織的影響多樣。尼古丁能夠降低牙周組織對炎性反應(yīng)的防御能力[8];從而加重牙槽骨吸收,最終影響牙周病的治療效果及預(yù)后[9]。但尼古丁引起牙周組織炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制尚不明了,仍有待進(jìn)一步闡明。

        近年來,α7 nAChR逐漸成為研究吸煙相關(guān)性牙周炎發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)。α7 nAChR作為尼古丁的特異性受體,與吸煙相關(guān)性牙周炎的發(fā)病過程息息相關(guān)[10]。課題組前期研究結(jié)果同樣指出大鼠和人類的牙周膜組織及細(xì)胞中存在α7 nAChR的功能性表達(dá),尼古丁可上調(diào)α7 nAChR表達(dá)造成實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠牙周組織破壞,且牙槽骨吸收程度與α7 nAChR的表達(dá)呈正相關(guān)[3,11]。α7 nAChR在口腔組織中廣泛分布,尼古丁對其表達(dá)的上調(diào)作用能夠被受體特異性拮抗劑α-BTX部分逆轉(zhuǎn)。α-BTX濃度選擇為課題組沿用濃度10-8M,這是由于α-BTX本身具有一定的細(xì)胞毒性,選擇這個濃度,既能發(fā)揮其拮抗α7 nAChR的作用,又能避免α-BTX本身對細(xì)胞的毒性作用干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。然而,尼古丁同受體結(jié)合后下游具體調(diào)控機(jī)制及其對牙周組織的生物學(xué)意義仍不明了。

        c-Fos基因同樣在細(xì)胞中廣泛存在,并對細(xì)胞的生長分化發(fā)揮調(diào)控作用。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激,數(shù)十分鐘內(nèi)即可表達(dá)產(chǎn)物為55 kDa的c-Fos蛋白,持續(xù)數(shù)十小時后恢復(fù)至正常[12]。c-Fos蛋白作為AP-1的成分,參與了細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞對損傷的反應(yīng)[13]。c-Fos基因作為早期即刻基因,有文獻(xiàn)報道稱在人牙周成纖維細(xì)胞中也發(fā)揮了損傷應(yīng)激作用,廣泛參與機(jī)體組織修復(fù)和炎性傳導(dǎo)。尼古丁可上調(diào)c-Fos mRNA的表達(dá),且其在1 h后達(dá)到峰值[6],這與本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。Beer等[14]在紅藻氨酸癲癇模型中用原位雜交技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)c-Fos蛋白表達(dá)水平與c-Fos mRNA表達(dá)具有高度一致性;Sng等[15]在紅藻氨酸癲癇模型中應(yīng)用免疫組化技術(shù)也同樣檢測到c-Fos蛋白與c-Fos mRNA可在應(yīng)激反應(yīng)早期發(fā)生改變。這些結(jié)果均印證了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)c-Fos基因及蛋白在尼古丁作用1 h后出現(xiàn)顯著升高。而在尼古丁作用濃度選擇上,雖然10-4M尼古丁在作用1 h后c-Fos mRNA表達(dá)改變最為顯著,但考慮到尼古丁的劇毒性,10-4M尼古丁或可使多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,發(fā)生不可逆反應(yīng),為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受其他因素干擾,作者采用10-5M尼古丁開展相關(guān)研究。且課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),這一濃度尼古丁最符合吸煙者齦溝液中尼古丁的實(shí)際濃度,最具有生理學(xué)角度的意義[3,11]。本研究結(jié)果同樣也證實(shí)10-5M尼古丁作用后c-Fos mRNA表達(dá)也出現(xiàn)了顯著上調(diào)。

        動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示尼古丁可使小鼠海馬結(jié)構(gòu)c-Fos蛋白表達(dá)升高,學(xué)者認(rèn)為其原因在于尼古丁激活了海馬結(jié)構(gòu)中的相關(guān)受體,釋放了神級遞質(zhì)作用于突觸后膜,轉(zhuǎn)而激活第二信使誘導(dǎo)c-Fos蛋白表達(dá)上調(diào)[16]。有研究證實(shí)尼古丁在人牙周膜細(xì)胞中可上調(diào)c-Fos基因的表達(dá)并顯著依賴于細(xì)胞硫醇的水平[6]。c-Fos在破骨細(xì)胞分化過程中也能夠調(diào)控RANKL的功能活性,RANKL激活后通過相關(guān)信號通路作用促進(jìn)前體細(xì)胞成為成熟的破骨細(xì)胞[17]。Yang和Peng[18]通過免疫組化及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法證實(shí)c-Fos與RANKL在根尖周病損中共同表達(dá),并且表達(dá)變化趨勢相同,呈正相關(guān)。由此作者推測,尼古丁作用于牙周膜細(xì)胞后表達(dá)升高的c-Fos調(diào)控了破骨細(xì)胞活化,進(jìn)而參與牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程。

        本研究發(fā)現(xiàn)尼古丁作用于人牙周膜細(xì)胞后促進(jìn)了c-Fos的表達(dá),這一作用可被α7 nAChR拮抗劑α-BTX拮抗。提示尼古丁可能通過作用于α7 nAChR調(diào)節(jié)c-Fos活性,參與牙周組織的破壞過程。

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