陳靜濤，周志斐，王 燕，宋 薇，李保東，陳新釗，衛(wèi)克文

牙周炎為口腔兩大常見病之一，是由于細(xì)菌感染導(dǎo)致牙周組織出現(xiàn)慢性感染性炎癥的一種疾病。其典型癥狀為牙槽骨吸收，牙齒松動脫落等。吸煙是牙周炎的重要影響因素，吸煙者牙周炎患病率高，病情重，治療效果及預(yù)后較差[1]。煙草中的尼古丁被證實(shí)在牙周組織的破壞過程中發(fā)揮重要作用。Kim等[2]證實(shí)尼古丁通過結(jié)合牙周膜干細(xì)胞上的煙堿型乙酰膽酰受體α7亞型（α7 acetylcholine receptor，α7 nAChR），加快牙周膜干細(xì)胞凋亡，降低牙周組織修復(fù)速度，且該現(xiàn)象存在濃度依賴性。課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠和人類的牙周組織中存在α7 nAChR的功能性表達(dá)，尼古丁通過α7 nAChR在牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的破壞性效應(yīng)可被受體特異性拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素（α-BTX）所部分抑制[3]。然而尼古丁和α7 nAChR結(jié)合后下游究竟是通過何種途徑造成牙周破壞，具體機(jī)制仍不清楚。c-Fos是破骨細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵因子，c-Fos基因敲除鼠表現(xiàn)為原發(fā)性脆骨硬化癥，過度表達(dá)c-Fos的轉(zhuǎn)基因鼠可出現(xiàn)軟骨肉瘤等癥狀[4]。c-Fos在破骨細(xì)胞分化過程中是RANKL重要調(diào)控因子，可調(diào)控下游因子促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[5]。Chang等[6]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，尼古丁可促進(jìn)人牙周膜中c-Fos的基因表達(dá)，且其效果顯著依賴于細(xì)胞硫醇的水平。為進(jìn)一步研究尼古丁作用于人牙周膜細(xì)胞后的效應(yīng)機(jī)制，本研究檢測了尼古丁作用后細(xì)胞c-Fos與α7 nAChR的相互關(guān)系，旨在探討尼古丁對人牙周膜細(xì)胞的影響，為進(jìn)一步揭示尼古丁參與吸煙相關(guān)性牙周炎的可能功能作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 尼古?。╓ako，日本）；DMEM培養(yǎng)基（GibcoBRL公司，美國）；胎牛血清（云天生物技術(shù)研究所，中國）；α-BTX（Santa，美國）；c-Fos小鼠抗人IgG單克隆抗體，山羊抗小鼠IgG二抗，RT-PCR試劑盒（Takara，中國）；RNA提取試劑盒（Omega，美國）；ABI7500實(shí)時定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國）；電泳儀，轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad，美國）；低溫離心機(jī)，微量移液器（Eppendorf，德國）。

1.2 牙周膜細(xì)胞培養(yǎng) 自空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院門診部口腔科收集健康無齲壞及根尖周感染的第一前磨牙，供體均為12～18歲青少年，牙齒均因正畸治療需要而被拔除。刮取根中1/3段牙周膜組織。滴管轉(zhuǎn)移組織塊及培養(yǎng)液至離心管中，1 000 r pm離心5 min棄上清，加入約1 ml DMEM培養(yǎng)液（含20%胎牛血清）至離心管，將組織塊吹打均勻，用滴管吸出，加入六孔板底，用蓋玻片覆蓋組織塊，置于37 °C恒溫孵箱（5% CO2、濕度100%）培養(yǎng)。當(dāng)孔內(nèi)細(xì)胞長至80%時，PBS沖洗2遍，每孔滴加約1 ml 0.25%的胰蛋白酶，反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液，1 000 rpm離心5 min后加入1 ml DMEM培養(yǎng)液（含20%胎牛血清），吹打均勻以1:3體積比轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶后置于恒溫培養(yǎng)箱。待細(xì)胞數(shù)量約占六孔板底面積80%時再次傳代，5代細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。取第5代人牙周膜細(xì)胞，以2×104個/ml接種于六孔板中，置于37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞鋪滿六孔板底部80%，形態(tài)、密度均達(dá)到良好狀態(tài)時加入含不同濃度尼古丁的培養(yǎng)液（0 M、10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、10-7M）作用不同時間（0、1、2、4、8、24 h），檢測尼古丁作用于人牙周膜細(xì)胞后c-Fos mRNA和蛋白的表達(dá)變化。α-BTX作用濃度為10-8M，隨尼古丁同時加入培養(yǎng)液以觀察其對尼古丁作用的阻斷效應(yīng)。分別以無尼古丁作用和尼古丁作用0 h為空白對照。

1.3 RNA提取及RT-PCR檢測 不同分組及不同處理細(xì)胞終止實(shí)驗(yàn)后行RT-PCR檢測。采用Omega提取細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）以10 μl反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于PCR擴(kuò)增。基因擴(kuò)增儀按照預(yù)設(shè)程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及基因擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃終延伸2 min，35個循環(huán)。所得PCR產(chǎn)物行凝膠電泳（120 V，25 min）實(shí)驗(yàn)，Bio-RadD凝膠定量軟件Quantity One 分析目的基因凝膠電泳結(jié)果，采集圖像。反應(yīng)完成后，采用CFX Manager軟件（Version 2.1）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算每組樣本Ct值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算2-△△Ct值，基于溶解曲線判斷擴(kuò)增產(chǎn)物是否具有特異性。引物由上海生工生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成（β-actin：上游為5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'下游為5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'；c-Fos：上游為5'-CTCCAGTGCCAACTTCATTCC-3'；下游為5’-CATCTTATTCCTTTCCCTTCGG-3'）。

1.4 蛋白提取和Western blot檢測 不同分組及不同處理細(xì)胞終止實(shí)驗(yàn)后提取蛋白，各組蛋白濃度利用BCA法進(jìn)行測定，定量后進(jìn)行凝膠電泳，每個泳道中的樣本蛋白含量相同。轉(zhuǎn)移目的蛋白至NC膜上后，封閉，加入c-Fos小鼠抗人IgG單克隆抗體，封膜，過夜孵育；洗膜，封山羊抗小鼠IgG二抗，掃膜；Bio-Rad Quantity One軟件進(jìn)行蛋白條帶定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，3組及以上的比較采用單因素方差分析(Oneway analysis of variance)，對實(shí)驗(yàn)組和對照組檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尼古丁作用后c-Fos mRNA變化的時間梯度及濃度梯度實(shí)驗(yàn) PCR結(jié)果提示，10-5M濃度尼古丁作用于牙周膜細(xì)胞1 h后c-Fos mRNA表達(dá)顯著升高(圖1)，而隨著作用時間的延長，c-Fos表達(dá)逐漸減低。當(dāng)作用時間限定為1 h時，PCR結(jié)果提示，較之于10-3M濃度，10-4M濃度尼古丁作用于牙周膜細(xì)胞后c-Fos mRNA表達(dá)顯著升高（圖2）。10-5M濃度尼古丁作用下c-Fos表達(dá)逐漸減低（P＜0.05）?？紤]尼古丁對細(xì)胞的毒性作用，本課題后續(xù)采用10-5M尼古丁作用于人牙周膜細(xì)胞1 h觀察相關(guān)指標(biāo)的改變。

圖1 尼古丁作用不同時間后人牙周膜細(xì)胞c-Fos mRNA的表達(dá)改變

圖2 不同濃度尼古丁對人牙周膜細(xì)胞c-Fos mRNA表達(dá)改變的影響

2.2 尼古丁和/或α-BTX對c-Fos蛋白表達(dá)的影響 Western blot及其半定量檢測結(jié)果提示，10-5M尼古丁作用于人牙周膜細(xì)胞1 h后，細(xì)胞c-Fos蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，約為空白對照的3倍，加入10-8M α-BTX后，c-Fos蛋白表達(dá)上調(diào)的趨勢得到顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 尼古丁對人牙周膜細(xì)胞c-Fos蛋白的影響

2.3 尼古丁和/或α-BTX對c-FosmRNA表達(dá)的影響 以10-5M尼古丁作用于牙周膜細(xì)胞1 h后，電泳圖顯示：10-5M尼古丁可上調(diào)c-Fos mRNA的表達(dá)，而α7 nAChR拮抗劑α-BTX可顯著抑制這一作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。單獨(dú)α-BTX作用于牙周膜細(xì)胞后，c-Fos mRNA的表達(dá)并未發(fā)生顯著改變（P＞0.05）（圖4）。實(shí)時定量PCR結(jié)果與反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果類似（圖5）。

圖4 尼古丁對人牙周膜細(xì)胞c-Fos mRNA表達(dá)的影響

圖5 實(shí)時定量PCR檢測尼古丁對人牙周膜細(xì)胞c-Fos mRNA表達(dá)的影響

3 討論

牙周炎發(fā)病率高，愈后較差，是導(dǎo)致成年患者牙列缺損、甚至缺失的主要病因[7]。吸煙是引起牙周炎的高危因素之一。尼古丁是煙草中的主要生物堿，占煙草生物堿總量的95%以上。尼古丁對牙周組織的影響多樣。尼古丁能夠降低牙周組織對炎性反應(yīng)的防御能力[8]；從而加重牙槽骨吸收,最終影響牙周病的治療效果及預(yù)后[9]。但尼古丁引起牙周組織炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制尚不明了，仍有待進(jìn)一步闡明。

近年來，α7 nAChR逐漸成為研究吸煙相關(guān)性牙周炎發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)。α7 nAChR作為尼古丁的特異性受體，與吸煙相關(guān)性牙周炎的發(fā)病過程息息相關(guān)[10]。課題組前期研究結(jié)果同樣指出大鼠和人類的牙周膜組織及細(xì)胞中存在α7 nAChR的功能性表達(dá)，尼古丁可上調(diào)α7 nAChR表達(dá)造成實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠牙周組織破壞，且牙槽骨吸收程度與α7 nAChR的表達(dá)呈正相關(guān)[3，11]。α7 nAChR在口腔組織中廣泛分布，尼古丁對其表達(dá)的上調(diào)作用能夠被受體特異性拮抗劑α-BTX部分逆轉(zhuǎn)。α-BTX濃度選擇為課題組沿用濃度10-8M，這是由于α-BTX本身具有一定的細(xì)胞毒性，選擇這個濃度，既能發(fā)揮其拮抗α7 nAChR的作用，又能避免α-BTX本身對細(xì)胞的毒性作用干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。然而，尼古丁同受體結(jié)合后下游具體調(diào)控機(jī)制及其對牙周組織的生物學(xué)意義仍不明了。

c-Fos基因同樣在細(xì)胞中廣泛存在，并對細(xì)胞的生長分化發(fā)揮調(diào)控作用。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，數(shù)十分鐘內(nèi)即可表達(dá)產(chǎn)物為55 kDa的c-Fos蛋白，持續(xù)數(shù)十小時后恢復(fù)至正常[12]。c-Fos蛋白作為AP-1的成分，參與了細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞對損傷的反應(yīng)[13]。c-Fos基因作為早期即刻基因，有文獻(xiàn)報道稱在人牙周成纖維細(xì)胞中也發(fā)揮了損傷應(yīng)激作用，廣泛參與機(jī)體組織修復(fù)和炎性傳導(dǎo)。尼古丁可上調(diào)c-Fos mRNA的表達(dá)，且其在1 h后達(dá)到峰值[6]，這與本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。Beer等[14]在紅藻氨酸癲癇模型中用原位雜交技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)c-Fos蛋白表達(dá)水平與c-Fos mRNA表達(dá)具有高度一致性；Sng等[15]在紅藻氨酸癲癇模型中應(yīng)用免疫組化技術(shù)也同樣檢測到c-Fos蛋白與c-Fos mRNA可在應(yīng)激反應(yīng)早期發(fā)生改變。這些結(jié)果均印證了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)c-Fos基因及蛋白在尼古丁作用1 h后出現(xiàn)顯著升高。而在尼古丁作用濃度選擇上，雖然10-4M尼古丁在作用1 h后c-Fos mRNA表達(dá)改變最為顯著，但考慮到尼古丁的劇毒性，10-4M尼古丁或可使多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，發(fā)生不可逆反應(yīng)，為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受其他因素干擾，作者采用10-5M尼古丁開展相關(guān)研究。且課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，這一濃度尼古丁最符合吸煙者齦溝液中尼古丁的實(shí)際濃度,最具有生理學(xué)角度的意義[3，11]。本研究結(jié)果同樣也證實(shí)10-5M尼古丁作用后c-Fos mRNA表達(dá)也出現(xiàn)了顯著上調(diào)。

動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示尼古丁可使小鼠海馬結(jié)構(gòu)c-Fos蛋白表達(dá)升高，學(xué)者認(rèn)為其原因在于尼古丁激活了海馬結(jié)構(gòu)中的相關(guān)受體，釋放了神級遞質(zhì)作用于突觸后膜，轉(zhuǎn)而激活第二信使誘導(dǎo)c-Fos蛋白表達(dá)上調(diào)[16]。有研究證實(shí)尼古丁在人牙周膜細(xì)胞中可上調(diào)c-Fos基因的表達(dá)并顯著依賴于細(xì)胞硫醇的水平[6]。c-Fos在破骨細(xì)胞分化過程中也能夠調(diào)控RANKL的功能活性，RANKL激活后通過相關(guān)信號通路作用促進(jìn)前體細(xì)胞成為成熟的破骨細(xì)胞[17]。Yang和Peng[18]通過免疫組化及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法證實(shí)c-Fos與RANKL在根尖周病損中共同表達(dá)，并且表達(dá)變化趨勢相同，呈正相關(guān)。由此作者推測，尼古丁作用于牙周膜細(xì)胞后表達(dá)升高的c-Fos調(diào)控了破骨細(xì)胞活化，進(jìn)而參與牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程。

本研究發(fā)現(xiàn)尼古丁作用于人牙周膜細(xì)胞后促進(jìn)了c-Fos的表達(dá)，這一作用可被α7 nAChR拮抗劑α-BTX拮抗。提示尼古丁可能通過作用于α7 nAChR調(diào)節(jié)c-Fos活性，參與牙周組織的破壞過程。