陳 圓，陳岸妃，李紅偉，張春紅，郭鵬舉

（1.惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣東廣州 510640；3.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510000）

惠陽(yáng)胡須雞，廣東省三大名雞之一，是我國(guó)優(yōu)良的地方雞種［1-2］．近年來隨著禽白血病病毒的入侵，當(dāng)?shù)厍蒺B(yǎng)殖業(yè)受到的危害日趨嚴(yán)重．禽白血病是由禽白血病病毒感染雞禽體內(nèi)而引發(fā)的的各種可傳染的良性或者惡性腫瘤疾病的統(tǒng)稱［3］，該病毒可通過感染雞禽類的血漿、泄殖腔、蛋清、精液等進(jìn)行傳播［4］．根據(jù)禽白血病病毒（ALV）的囊膜蛋白的抗原性、交叉免疫反應(yīng)等多種特性，將禽白血病病毒分為A、B、C、D、E、K、J共7個(gè)亞群［5-9］．目前，檢測(cè)禽白血病常用的方法為ALV p27抗原的ELISA方法，雖然ELISA檢測(cè)靈敏快速，但無法區(qū)分內(nèi)源性禽白血病病毒［10-11］；gp85基因體外擴(kuò)增（PCR）診斷技術(shù)，通過ALV囊膜gp85基因兩端的一段序列分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測(cè)，雖然靈敏度較高，但假陽(yáng)性也高．顯然，這些方法均有一定的缺陷，無法對(duì)禽白血病病毒進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析［12-14］．

PCR—高分辨熔解曲線分析技術(shù)（PCR-high resolution melting curve analysis，PCR-HRM）是將RT-PCR與HRM分析技術(shù)兩者聯(lián)合起來．RT-PCR技術(shù)在分析基因的轉(zhuǎn)錄水平、獲取目的基因、合成cDNA探針等方面有著廣泛的運(yùn)用，使RNA檢測(cè)的靈敏性大大提高，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能，該方法成為早期診斷禽白血病較穩(wěn)定、快速、靈敏的方法［15-17］．HRM是近年來興起的單核苷酸多態(tài)性（SNP）和基因分型快速檢測(cè)新方法，通過實(shí)時(shí)監(jiān)控升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況，在基因分型、甲基化研究等方面發(fā)揮著重要作用［18-20］．

本研究擬采用PCR-HRM技術(shù)，根據(jù)ALV A、B、E、K和J亞群禽白血病病毒囊膜糖蛋白gp85基因序列分別設(shè)計(jì)出一對(duì)A、B、E、K亞型通用引物和一對(duì)J亞型特異引物，從而對(duì)ALV不同亞型病毒進(jìn)行分類與鑒定，以此建立一種區(qū)分禽白血病病毒內(nèi)源型和外源型的PCR-HRM快速靈敏診斷方法．

1 材料與方法

1.1 樣本來源

隨機(jī)采集400例惠陽(yáng)胡須雞外周血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝保存于-80℃冰箱備用．

1.2 試劑

血液RNA提取試劑盒、PCR Mix購(gòu)自天根科技（北京）有限公司．

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

由于ALV的不同亞型是根據(jù)ALV gp85基因序列同源性進(jìn)行分型，因此根據(jù)NCBI上ALV的gp85基因設(shè)計(jì)了一對(duì)只擴(kuò)增J亞型的特異性引物，上游引物P1：5’-CAGGAAACGTGTGGGTCACC-3’；下游引物P2：5’-TTATTGGACTTACCATCG-3’．還設(shè)計(jì)了一對(duì)可以同時(shí)區(qū)分A、B、E、K亞型的通用引物，上游引物P3：5’-CCTTGCTGCCAACGACACTTA-3’；下游引物P4：5’-GAACCTARCAGYTGTAGTC-3’．

1.4 RT-PCR擴(kuò)增和HRM分析

提取的RNA/DNA為目標(biāo)模板，用J-亞型特異引物和A、B、E、K通用引物分別進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增．參照PrimeScript? One Step RT-PCR Kit（TAKARA）產(chǎn)品說明書，按以下組成配制RT-PCR反應(yīng)液．

表1 RT-PCR反應(yīng)體系

將反應(yīng)體系混勻，置于Rotor-Gene QTM儀，RTPCR和HRM運(yùn)行程序如下：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；終延伸72℃8 min．HRM升溫步驟為75℃至90℃，升溫速率為0.3℃/step．RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果用Rotor-Gene QTM軟件進(jìn)行分析.

2 結(jié)果分析

2.1 PCR-HRM結(jié)果分析

圖1顯示RT-PCR完成后進(jìn)行凝膠電泳分析，A1、B1、E1、J1代表禽白血病不同亞型，確認(rèn)目的條帶外無其它雜帶；圖2顯示對(duì)原始熔解曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理降低PCR產(chǎn)物濃度差異對(duì)HRM分型結(jié)果的影響；圖3顯示對(duì)不同亞型的病毒標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線進(jìn)行導(dǎo)數(shù)化處理，由此可知禽白血病不同亞型的溶解曲線所代表的峰型存在差異，增強(qiáng)HRM辨別能力；圖4顯示利用HRM形狀和Tm值差異均接近時(shí)顯示差異化熔解曲線表示不同禽白血病病毒亞型．

圖1 禽白血病4個(gè)亞型電泳圖

圖2 禽白血病4個(gè)亞型標(biāo)準(zhǔn)化HRM圖

圖3 禽白血病4個(gè)亞型峰型化HRM圖

圖4 禽白血病4個(gè)亞型差異化HRM圖

2.2 對(duì)惠陽(yáng)胡須雞禽白血病檢測(cè)結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)惠州市不同地區(qū)惠陽(yáng)胡須雞隨機(jī)采集400個(gè)血液樣品，其中包括56只種公雞、144只商品代小母雞和200只種母雞檢測(cè)樣品．通過PCR-高分辨熔解曲線分析400只惠陽(yáng)胡須雞禽白血病感染情況．其檢測(cè)結(jié)果如表2．

表2 惠陽(yáng)胡須雞禽白血病不同病毒亞型感染情況分析

惠陽(yáng)胡須雞禽白血病無感染A、B亞型的白血病，表示A、B亞型的白血病已得到很好凈化．但E亞型禽白血病患病率極高，并存在J、E同時(shí)感染的情況，E亞型白血病屬于內(nèi)源性病毒，并且它導(dǎo)致雞患腫瘤的可能性很低，危害較小，但在某些情況也會(huì)影響雞群生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致食欲降低等多種不良癥狀．J亞型禽白血病病毒感染率高，且有潛在致病性，可能會(huì)造成群體內(nèi)水平傳播，或者垂直傳播影響后代的隱患，因此要加大J亞型禽白血病的防控和凈化．

3 討論和結(jié)論

據(jù)王廣龍等［21］和曹偉勝等［22］對(duì)禽白血病的相關(guān)研究，其中介紹了多種禽白血病檢測(cè)方法，如病毒的分離與鑒定、ALV p27抗原的ELISA方法［23-25］和ALV 27相關(guān)病毒PCR檢測(cè)技術(shù)［26-27］．目前，檢測(cè)ALV的傳統(tǒng)診斷方法是ALV p27抗原的ELISA檢測(cè)，國(guó)內(nèi)外ELISA診斷試劑盒已基本實(shí)現(xiàn)商品化．該方法需要采集不同日齡的雞血漿并接種到培養(yǎng)細(xì)胞來檢測(cè)p27抗原，病毒的分離與鑒定結(jié)果為陽(yáng)性就淘汰，其檢測(cè)過程靈敏快速，但易受內(nèi)源性禽白血病毒干擾而產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)無法鑒別是否屬于內(nèi)源性禽白血病病毒．而ALV病毒PCR檢測(cè)技術(shù)可從少量的DNA樣品中檢測(cè)出ALV，具有較高的靈敏度，但該P(yáng)CR技術(shù)在個(gè)別情況下會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性擴(kuò)增，且當(dāng)禽白血病病毒發(fā)生變異時(shí)則無法檢測(cè)．總之，以上方法均存在一定的缺陷，尤其對(duì)內(nèi)源型禽白血病病毒檢測(cè)時(shí)，需要細(xì)胞培養(yǎng)才能完成檢測(cè)，延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間，影響禽白血病的快速檢測(cè)及凈化．

ALV病毒PCR-HRM檢測(cè)方法，根據(jù)目標(biāo)ALV A、B、E、K和J亞群禽白血病病毒囊膜糖蛋白gp85基因DNA序列的長(zhǎng)度、GC堿基對(duì)的含量及堿基之間的互補(bǔ)性差異，利用高分辨率的熔解曲線對(duì)樣品的基因型進(jìn)行判定，用于高通量的gp85基因突變掃描進(jìn)行基因分型．

本方法包括RT-PCR和HRM兩個(gè)部分．RTPCR即逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，提取惠陽(yáng)胡須雞血液的mRNA作為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得gp85基因DNA序列目的基因進(jìn)行檢測(cè)基因表達(dá)檢測(cè)．用于HRM分析的染料有必須滿足兩個(gè)條件：第一是染料必須是飽和，以使所有的雙鏈DNA的小溝位置都能與染料結(jié)合，這樣雙鏈DNA在升溫解鏈時(shí)，飽和染料就能從雙鏈DNA上脫落，此時(shí)熒光信號(hào)就會(huì)減弱，這樣就能準(zhǔn)確反應(yīng)出樣品熔解溫度（Tm）；第二，HRM分析所用的染料對(duì)PCR反應(yīng)無抑制作用．

ALV病毒PCR-HRM檢測(cè)方法相對(duì)于傳統(tǒng)ALV檢測(cè)，其優(yōu)勢(shì)在于：操作簡(jiǎn)單，在進(jìn)行PCR反應(yīng)之前加入熒光飽和染料即可；檢測(cè)速率高，每5～10分鐘完成96/384孔板的PCR產(chǎn)物檢測(cè)，不需要進(jìn)行病毒的細(xì)胞培養(yǎng)，因此極大程度的縮短了檢測(cè)時(shí)間；準(zhǔn)確性高達(dá)95%、特異性高達(dá)99%，重復(fù)性達(dá)到100%；檢測(cè)分析的費(fèi)用較低，每個(gè)樣品所需要的熒光染料成本為1.6 RMB；本方法能較快鑒別ALV內(nèi)源和外源性病毒，更重要的是能對(duì)病毒序列變化進(jìn)行長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)．