姚瑞強(qiáng)
(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院,山西 汾陽 032200)
肝臟脂肪含量被認(rèn)為是糖尿病、心血管疾病的重要危險因素,減少肝臟脂肪沉積可減少肝細(xì)胞凋亡、壞死及炎癥反應(yīng),非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是無過量飲酒史人群以肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪變性及脂肪儲積為特征的病理綜合征,包括非酒精性肝脂肪變性(Non-alcholic fatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、肝硬化及肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)[1-2]。磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)具有脂類激酶及蛋白激酶活性,PI3K家族作為機(jī)體生長因子信號傳導(dǎo)中一類重要因子,可被多種細(xì)胞因子及理化因素激活,并催化磷脂酰肌醇,使其羧基端發(fā)生磷酸化,繼而出現(xiàn)有信使作用的肌醇類激酶,蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,為PI3K/AKT信號通路的主要下游分子,在各種信號級聯(lián)中充當(dāng)PI3K下游的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物,該信號通路有促凋亡、增殖、分泌、趨化等作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT通路的抑制可導(dǎo)致胰島素抵抗(Insulin resistance,IR),繼而促進(jìn)NAFLD的進(jìn)展[4]。奧利司他作為非中樞性減重藥物,可與胃、胰脂肪酶的絲氨酸殘基結(jié)合,使脂肪酶失去活性,導(dǎo)致食物中的脂肪不能被分解為游離脂肪酸(Free fatty acid,F(xiàn)FA),抑制脂肪利用及吸收。早期有研究發(fā)現(xiàn),奧利司他可作為治療藥物來改善肝臟損傷性生化指標(biāo),但非首選藥,可作為姑息治療選擇[5]。Esmail等人最新研究發(fā)現(xiàn),短期奧利司他療法可改善NAFLD和代謝綜合征患者脂肪浸潤指數(shù)、肝纖維化評分[6],然而目前關(guān)于奧利司他對NAFLD的作用機(jī)制研究甚少。本文主要分析奧利司他對NAFLD模型大鼠的保護(hù)作用及PI3K/AKT信號通路的影響。
健康清潔級6~8周雄性SD大鼠(165~190 g)30只,購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。
BS-0220生化分析儀(深圳邁瑞),UV-2550分光光度計(日本津島);電泳儀(美國BIO-RAD),凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD)。高脂飼料,上海斯萊克;甘油三酯(Triglyceride,TG)、空腹血糖(Fiber bragg grating,F(xiàn)BG)、空腹胰島素(Fasting serum lisulin,F(xiàn)INS)測定試劑盒均購自北京中生北控生物科技;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-Glutamyltransferase,GGT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase,AST)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo Fisher公司);PI3K和AKT一抗購自Thermo公司。
所有大鼠隨機(jī)分為3組,每組10只,以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,開始對大鼠進(jìn)行為期8周的NAFLD模型構(gòu)建。對照組繼續(xù)喂食普通飼料,模型組改喂食高脂飼料,奧利司他組在模型組飼養(yǎng)基礎(chǔ)上灌胃奧利司他(規(guī)格:60 mg,湖南明瑞制藥,國藥準(zhǔn)字:H20183303)60 mg·(kg·d)-1。記錄每日攝食量。在實驗結(jié)束前12 h開始禁食,自由飲水。實驗結(jié)束時稱量大鼠增長體質(zhì)量。
禁食10 h后進(jìn)行葡萄糖耐受實驗,取大鼠尾靜脈血分離血清,測定FBG。同時按試劑盒說明書測定腹主動脈血清FINS,計算胰島素敏感指數(shù)(Insulin sensitivity index,ISI),ISI=l/(空腹血糖×空腹胰島素)。
禁食12 h后乙醚麻醉大鼠,腹主動脈取血,取肝臟、肌肉等臟器組織稱重。每只大鼠準(zhǔn)確稱取20 mg肝臟,制作肝臟勻漿,依據(jù)試劑盒說明書測定TG。勻漿經(jīng)室溫靜置30 min后3000 rpm離心10 min分離血清,測定AST、GGT、ALT。
取新鮮肝組織,以O(shè)CT包埋劑包埋,甲醛鈣固定,60%異丙醇清洗,油紅O染色液染色,60%異丙醇洗浮色,蒸餾水水洗,蘇木精復(fù)染核,蒸餾水洗,晾干后封片觀察、攝片。
采用Western blot法測定肝組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平。取適量肌組織加RIPA裂解液,提取蛋白,以BCA試劑盒測定其濃度。采用SDSPAGE電泳進(jìn)行分裂,轉(zhuǎn)膜,BSA封閉。加一抗及經(jīng)HRP標(biāo)記的二抗孵育,加化學(xué)發(fā)光試劑顯色,拍照并統(tǒng)計灰度值。
應(yīng)用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示,采用單因素方差分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
攝食期間三組攝食量、增長體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),模型組、奧利司他組肝臟質(zhì)量高于對照組(P<0.05)。見表1。
對照組肝細(xì)胞胞漿、胞核呈藍(lán)色,無明顯橘紅色脂滴,模型組肝細(xì)胞胞漿中可發(fā)現(xiàn)許多大小不等橘紅色脂滴,且呈彌漫性分布,提示造模成功,奧利司他組肝細(xì)胞脂滴較模型組縮小且減少,染色變淺,但仍較對照組深。見圖1。
表1 三組攝食量、增長體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量比較(±SD,n=10)
表1 三組攝食量、增長體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量比較(±SD,n=10)
注:與對照組相比,*P<0.05。
組別 攝食量(g·d-1) 增長體質(zhì)量(g) 肝臟質(zhì)量(g) 對照組 19.18±2.03 56.82±5.86 14.21±1.58 模型組 21.22±2.25 60.44±6.18 22.03±2.54* 奧利司他組 21.36±2.35 60.72±6.13 22.75±2.38*
圖1 各組大鼠肝組織油紅O染色結(jié)果(×200)
模型組TG、ALT、GGT、AST明顯高于對照組(P<0.05),奧利司他組TG、ALT、GGT、AST明顯低于模型組(P<0.05)。見表2。
模型組FBG、FINS高于對照組(P<0.05),ISI明顯低于對照組(P<0.05),奧利司他組FBG、FINS明顯低于模型組(P<0.05),ISI明顯高于模型組(P<0.05)。見表3。
與對照組相比,模型組肝組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平更低,而奧利司他組的肝組織中PI3K、AKT蛋白的表達(dá)水平高于模型組(P<0.05)。見圖2。
表2 三組脂質(zhì)含量與肝功能酶學(xué)指標(biāo)比較(±SD,n=10)
表2 三組脂質(zhì)含量與肝功能酶學(xué)指標(biāo)比較(±SD,n=10)
注:與對照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。
組別 TG(mg·g-1) ALT(IU·g-1) GGT(IU·g-1) AST(IU·g-1) 對照組 10.15±1.16 10.54±1.27 56.43±5.57 3.97±0.45 模型組 123.41±14.58* 28.67±2.93* 70.19±7.18* 15.13±1.62* 奧利司他組 71.89±7.26*# 18.23±1.85*# 62.35±6.37*# 13.11±1.89*#
表3 三組血糖代謝指標(biāo)比較(±SD,n=10)
表3 三組血糖代謝指標(biāo)比較(±SD,n=10)
注:與對照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05。
組別 FBG(mmol·L-1) FINS(μg·L-1) ISI 對照組 5.43±0.57 0.10±0.02 -2.35±0.26 模型組 6.54±0.68* 0.21±0.04* -3.18±0.34* 奧利司他組 5.21±0.54# 0.16±0.02*# -2.63±0.29#
圖2 三組PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平比較
NAFLD是由代謝應(yīng)激誘導(dǎo)的肝損傷性疾病[7-8]。NAFLD的病因主要是IR及其代謝紊亂構(gòu)成脂肪浸潤肝臟首次打擊,而肝臟脂質(zhì)沉積也是其最大特點,因此改善脂質(zhì)及胰島素代謝是該病的治療重點[9]。奧利司他是非作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物[10],對NAFLD有改善作用,但奧利司他對NAFLD的治療效果與機(jī)制研究甚少。PI3K/AKT為對細(xì)胞增殖、分化、凋亡及衰老進(jìn)行調(diào)節(jié)的關(guān)鍵信號通路,與細(xì)胞增殖、凋亡之間存在密切關(guān)系[11],關(guān)于NAFLD發(fā)展與PI3K/AKT信號通路的關(guān)系目前已有研究[12],而奧利司他是否通過影響該信號通路對NAFLD發(fā)揮肝保護(hù)作用目前未見研究。
本研究發(fā)現(xiàn)奧利司他組大鼠肝細(xì)胞脂滴較模型組縮小且減少,染色變淺,但仍較對照組深,提示高脂飲食導(dǎo)致大量肝臟脂肪細(xì)胞沉積,而奧利司他可有效減少肝臟脂肪細(xì)胞浸潤,延緩NAFLD進(jìn)展[13-14]。
IR及高胰島素血癥共同作用導(dǎo)致肝臟內(nèi)FFA及TG增多,大量FFA進(jìn)入血液,使細(xì)胞色素酶P450ⅡE1(Recombinant cytochrome P450 2E1,CYP2E1)表達(dá)增多,造成氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)過量生成,多次平行撞擊使氧化應(yīng)激增加,脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷,引起炎癥細(xì)胞聚集,使肝臟由炎癥、NAFL到NASH及纖維化進(jìn)展,從而起著雙重作用,影響NAFLD發(fā)病進(jìn)程。本研究對三組脂質(zhì)含量及肝功能酶學(xué)指標(biāo)的觀察發(fā)現(xiàn),奧利司他能較好減輕NAFLD的脂質(zhì)代謝水平,改善其肝功能。奧利司他為非中樞性減重藥,可選擇性與腸道脂肪酶活性絲氨酸殘基共價結(jié)合而使酶失去活性,繼而抑制TG水解,使TG及FFA攝入減少,體內(nèi)原有脂肪分解供能,達(dá)到控制體重、改善高血糖、高血脂的作用[15],這也是奧利司他組糖代謝水平優(yōu)于模型組的原因。
PI3K/AKT通路為胰島素信息進(jìn)行傳導(dǎo)主要通路,參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及蛋白質(zhì)形成、代謝等生物學(xué)過程[16-17]。AKT為PI3K/AKT信號通路中心環(huán)節(jié)[18-19],為PI3K信號傳導(dǎo)重要的下游靶激酶[20]。本次模型組肝組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平低于對照組,奧利司他組肝組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平高于模型組,表明奧利司他可通過激活PI3K/AKT信號通路而發(fā)揮對NAFLD的肝保護(hù)作用。PI3K可使其下游靶蛋白AKT磷酸化,形成p-AKT,p-AKT進(jìn)一步使糖原合成酶激酶-3β磷酸化、失去活性,繼而喪失誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用,此外p-AKT也能抑制促凋亡蛋白caspase、Bad及Bax合成,從而抑制細(xì)胞凋亡,當(dāng)PI3K/AKT信號通路被激活后可促進(jìn)細(xì)胞增殖,相反該信號通路被抑制則可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,應(yīng)用奧利司他后PI3K/AKT信號通路可調(diào)節(jié)胰島素信號通路,介導(dǎo)胰島素抵抗及細(xì)胞增殖、周期調(diào)節(jié)等,從而起到肝保護(hù)作用[21]。
綜上所述,奧利司他可通過激活PI3K/AKT信號通路而保護(hù)NAFLD模型大鼠的肝功能,從而改善肝臟脂質(zhì)含量、肝功能酶學(xué)指標(biāo)以及血糖水平。