曹志龍，李德龍，陳冰婷，蘇比努爾·巴克，馬曉麗△

(1.武警兵團(tuán)總隊(duì)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830063；2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

2型糖尿病等代謝性疾病是僅次于心、腦血管病和癌癥的世界性重大疾病。胰島素抵抗(IR)是導(dǎo)致2型糖尿病的主要病理基礎(chǔ)[1]。目前，氧化應(yīng)激的“二次打擊”學(xué)說已占據(jù)IR研究的核心地位[2]。氧化應(yīng)激能進(jìn)一步加重IR，是2型糖尿病及其并發(fā)癥產(chǎn)生的病理之一[3-4]。因此，探究IR和氧化應(yīng)激作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)更高效的具有抗氧化、減輕IR的物質(zhì)為2型糖尿病前期IR的預(yù)防提供一個(gè)嶄新的方法和思路。目前，合理的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的預(yù)防和控制糖尿病的重要舉措[5]。?；撬嵊址Q為β-氨基乙磺酸，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可有效清除體內(nèi)大部分氧自由基，具有抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、降低組織氧耗等諸多作用[6]。Keap1-Nrf2通路是目前研究氧化應(yīng)激的熱點(diǎn)[7]。本研究在HepG2細(xì)胞IR模型中給予不同質(zhì)量濃度?；撬幔ㄟ^檢測(cè)細(xì)胞存活率、評(píng)估氧化應(yīng)激指標(biāo)，以及Keap1-Nrf2通路關(guān)鍵因子的mRNA表達(dá)水平的測(cè)定，分析了?；撬釋?duì)IR-HepG2細(xì)胞的氧化損傷保護(hù)作用及可能機(jī)制，旨在為?；撬岣纳铺悄虿R提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 HepG2人肝癌細(xì)胞株來源于凱基生物，細(xì)胞培養(yǎng)條件為MEM 培養(yǎng)基、10%胎牛血清聯(lián)合1%PS，以及37 ℃、5%二氧化碳(CO2)、飽和濕度。

1.1.2儀器與試劑 Smart Cell HF-90 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力康儀器有限公司)、TGL-16GB臺(tái)式低速離心機(jī)(上海飛鴿儀器有限公司)、DNP-9272恒溫箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、DHG型恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、Eclipse TS100-F熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)、xMarkTM酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)、恒溫水浴鍋、K5500核酸蛋白定量?jī)x(北京凱奧公司)、2500凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)系統(tǒng)(美國(guó)ABI公司)、胎牛血清(FND500，Excell Bio)、杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(KGM41500-500，凱基生物)、青霉素-鏈霉素雙抗(10 000 U，SC30010，GIBCO)、CCK8 試劑(FC101-03，北京全式金生物)、二甲基亞砜(D2650，美國(guó)SIGMA公司)、棕櫚酸(P0500，美國(guó)SIGMA公司)、?；撬?T-0625，美國(guó)SIGMA公司)、丙二醛(MDA)試劑盒(A003-4，南京建成)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(A001-3，南京建成)、活性氧(ROS)試劑盒(E004，南京建成)、葡萄糖試劑盒(361500，上海榮盛生物藥業(yè)有限公司)等。

1.2方法

1.2.1HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 將解凍后的細(xì)胞快速加入至15 mL離心管中，離心棄上清液，將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，加入10%胎牛血清、1%雙抗的杜氏改良Eagle培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基,37 ℃、飽和濕度、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好匯合率達(dá)90%的HepG2細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞后用完全培養(yǎng)基制備成5×104cells/mL單細(xì)胞懸液，每24小時(shí)接種至96孔板中(每孔100 μL，5個(gè)復(fù)孔),置于培養(yǎng)箱中37 ℃孵育用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2建立HepG2細(xì)胞IR模型 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好匯合率達(dá)90%的HepG2細(xì)胞胰酶消化細(xì)胞后用完全培養(yǎng)基制備成5×104cells/mL單細(xì)胞懸液，接種至6孔板中(每孔2 mL，即每孔1×105cells)；HepG2細(xì)胞正常培養(yǎng)貼壁后換用無血清MEM培養(yǎng)基添加1%牛血清清蛋白(BSA)和0.5 mmol/L棕櫚酸培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，建立IR細(xì)胞模型。

1.2.3CCK8檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好匯合率達(dá)90%的HepG2細(xì)胞胰酶消化細(xì)胞后用完全培養(yǎng)基制備成5×104cells/mL單細(xì)胞懸液，接種至96孔板中(每孔2 mL，即每孔5×103cells)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h 貼壁后棄上清液，加入100 μL無血清MEM培養(yǎng)基添加1%BSA、0.5 mmol/L棕櫚酸配制的不同質(zhì)量濃度(10、100、500、2 000、5 000 μg/mL)的?；撬崛芤?，每組5個(gè)重復(fù)，放入培養(yǎng)箱37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后棄上清液，每孔加入10%CCK8 100 μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h；采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(OD)值，取均值并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4分組與葡萄糖含量檢測(cè) 將HepG2細(xì)胞分為空白對(duì)照組(加不含血清含1%BSA的MEM培養(yǎng)基)、模型組(加不含血清含1%BSA、0.5 mmol/L棕櫚酸的MEM培養(yǎng)基)、10 μg/mL?；撬峤M(加不含血清含1%BSA、0.5 mmol/L棕櫚酸、10 μg/mL?；撬崛芤旱腗EM培養(yǎng)基)、100 μg/mL?；撬峤M(加不含血清含1%BSA、0.5 mmol/L棕櫚酸、100 μg/mL牛磺酸溶液的MEM培養(yǎng)基)和500 μg/mL?；撬峤M(加不含血清含1%BSA、0.5 mmol/L棕櫚酸、500 μg/mL牛磺酸溶液的MEM培養(yǎng)基)。每組5個(gè)重復(fù)，37 ℃干預(yù)24 h。棄掉舊的細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含1×10-9mol/L胰島素的無血清MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h。收集每孔細(xì)胞上清液，檢測(cè)葡萄糖含量。取10 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液、10 μL蒸餾水、10 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品分別與1 000 μL工作液充分混勻置于37 ℃水浴15 min。顯色后在2 h內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定505 nm處的OD值，根據(jù)所得的OD值計(jì)算葡萄糖含量[(樣本OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)]×標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度。

1.2.5ROS、MDA、SOD檢測(cè) 按1.2.4項(xiàng)方法，收集細(xì)胞上清液用于SOD檢測(cè)，分別消化收集細(xì)胞用于ROS和MDA檢測(cè)。按MDA、ROS、SOD試劑盒說明書操作，測(cè)定各指標(biāo)，計(jì)算結(jié)果。

1.2.6半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)Nrf2、Keap1、血紅素氧合酶1(HO-1)、醌氧化還原酶(NQO1)mRNA的表達(dá) 按1.2.4項(xiàng)方法，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液洗滌貼壁細(xì)胞2次，加入1 mL Trizol裂解細(xì)胞，15 min后移至1.5 mL氯化聚氯乙烯管中，用于半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)。各引物列表見表1。采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，熒光定量PCR程序見表2。進(jìn)行熒光定量分析后采用絕對(duì)定量法計(jì)算mRNA的表達(dá)量。

表1 熒光定量引物信息表

表2 熒光定量PCR程序

2 結(jié) 果

2.1不同質(zhì)量濃度?；撬釋?duì)HepG2細(xì)胞株干預(yù)24 h后的作用結(jié)果比較 使用0～5 000 μg/mL質(zhì)量濃度對(duì)牛磺酸干預(yù)后細(xì)胞存活率的OD值均接近1.0。見圖1。表明藥物對(duì)細(xì)胞增殖無顯著影響。干預(yù)劑量在5 000 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率有所下降，最終考察了10、100、500 μg/mL對(duì)HepG2細(xì)胞IR狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用。

圖1 不同質(zhì)量濃度?；撬釋?duì)HepG2細(xì)胞株干預(yù)24 h后作用結(jié)果比較

2.2?；撬釋?duì)IR-HepG2細(xì)胞糖消耗的影響 模型組細(xì)胞糖消耗量[(3.867±0.226)mmol/L]明顯低于空白對(duì)照組[(5.330±0.126)mmol/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明建模成功。與模型組比較，10、100、500 μg/mL?；撬峋懿煌潭却龠M(jìn) HepG2 細(xì)胞糖消耗[分別為(4.455±0.055)、(4.342±0.204)、(4.940±0.205)mmol/L]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3?；撬釋?duì)IR-HepG2細(xì)胞ROS、MDA水平，以及SOD活性的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞ROS、MDA 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SOD活性降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，10、100、500 μg/mL?；撬峤M細(xì)胞ROS水平均明顯降低，100、500 μg/mL?；撬峤M細(xì)胞MDA水平均明顯降低，500 μg/mL?；撬峤M細(xì)胞SOD水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 ?；撬釋?duì)IR-HepG2細(xì)胞ROS、MDA水平及SOD活性的影響

2.4?；撬釋?duì)Nrf2-Keap1通路中關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞Keap1 mRNA表達(dá)明顯升高，HO-1、NQO1 mRNA表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Nrf2 mRNA表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，100、500 μg/mL?；撬峤M細(xì)胞Keap1 mRNA表達(dá)明顯降低，Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達(dá)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 牛磺酸對(duì)Nrf2-Keap1通路中關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)的影響

圖2 ?；撬釋?duì)Nrf2-Keap1通路中關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)的影響(n=3)

3 討 論

本研究建立了棕櫚酸誘導(dǎo)的 HepG2 細(xì)胞產(chǎn)生IR[8]，通過不同質(zhì)量濃度棕櫚酸干預(yù)不同時(shí)間，通過葡萄糖消耗最終確定0.5 mmol/L棕櫚酸誘導(dǎo)細(xì)胞24 h可成功建立IR細(xì)胞模型。通過CCK8預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了?；撬岣深A(yù)的3個(gè)劑量組，分別為10、100、500 μg/mL，通過檢測(cè)各組葡萄糖消耗量、ROS水平初步評(píng)價(jià)了?；撬釋?duì)IR細(xì)胞模型糖代謝及氧消耗的影響。結(jié)果顯示，?；撬岣深A(yù)前模型組細(xì)胞葡萄糖消耗明顯降低，?；撬岣深A(yù)后各劑量組均能提高葡萄糖的消耗量及ROS水平，表明?；撬峥擅黠@改善細(xì)胞模型的糖代謝紊亂情況。

近年來，氧化應(yīng)激損傷越來越多地被證明與IR密切相關(guān)，過多的氧自由基可促發(fā)機(jī)體進(jìn)一步產(chǎn)生IR[9-10]。MDA、SOD均是機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志性指標(biāo)[11]。MDA 作為脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一，可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映細(xì)胞氧化損傷程度;而體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，如SOD等則能減少氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，其活性高低反映機(jī)體的抗氧化能力。IR會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)無氧酵解過程增強(qiáng)，發(fā)生糖代謝障礙，而細(xì)胞內(nèi)持續(xù)高糖狀態(tài)又會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致脂質(zhì)代謝產(chǎn)物生成增加，加重代謝紊亂。本研究對(duì)細(xì)胞水平SOD、MDA的研究結(jié)果顯示，在有效質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同質(zhì)量濃度?；撬峤M對(duì)細(xì)胞存活率無顯著影響。模型組細(xì)胞MDA水平增高，SOD活性下降，說明IR細(xì)胞模型會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激失衡，而給予?；撬岣深A(yù)后細(xì)胞水平的氧化應(yīng)激損傷得到改善，尤其500 μg/mL牛磺酸能顯著降低細(xì)胞MDA水平,升高SOD活力，說明?；撬崮芗m正細(xì)胞的糖代謝紊亂，改善氧化應(yīng)激損傷從而減輕IR。

Keap1-Nrf2信號(hào)通路是近年來抗氧化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn),以Keap1-Nrf2信號(hào)通路介導(dǎo)多種抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶的轉(zhuǎn)錄,被認(rèn)為是抗氧化機(jī)制中最重要的通路[12-13]。當(dāng)細(xì)胞暴露于ROS時(shí)可引起細(xì)胞骨架相關(guān)性抑制蛋白的修飾(如磷酸化),從而使Keap1-Nrf2復(fù)合體解離,Nrf2由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核,與受其調(diào)控的抗氧化酶基因的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,從而增加抗氧化蛋白水平,促進(jìn)細(xì)胞存活。因此，激活Keap1-Nrf2信號(hào)通路、減少ROS的產(chǎn)生可改善氧化應(yīng)激，而HO-1、NQO1是Nrf2調(diào)控氧化應(yīng)激的主要酶類靶基因[14-15]。本研究結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞發(fā)生IR時(shí)Keap1 mRNA 水平明顯升高，而Nrf2 mRNA水平明顯降低，說明IR模型成立后細(xì)胞水平的Keap1-Nrf2信號(hào)通路發(fā)生了解離，而?；撬岣深A(yù)后各靶基因的異常表達(dá)明顯改善。通過進(jìn)一步檢測(cè)HO-1、NQO1 mRNA表達(dá)，結(jié)果也顯示出干預(yù)后這2個(gè)靶基因表達(dá)明顯升高，說明?；撬峥擅黠@干預(yù)Keap1-Nrf2信號(hào)通路。

綜上所述，?；撬峥赡芡ㄟ^降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平、提升細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性減少自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，增加細(xì)胞的抗氧化功能，減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激，從而減輕IR。其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2通路相關(guān)基因的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞IR的調(diào)控作用。