王虎斌,黃衛(wèi)胤,溫玉發(fā),孫 玲,陳 爽,喬紅群

(1.南京工業(yè)大學(xué) 江蘇省藥物研究所 安全性評價中心,江蘇 南京 211800;2.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京 211800)

1995年美國食品藥品管理局(FDA)首次提出的生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(BCS),是根據(jù)藥物在胃腸道中的溶解性和藥物通過腸道膜的滲透性對藥物進行分類的框架[1]。2016年國家市場監(jiān)督管理總局基于BCS分類頒發(fā)了《人體生物等效性試驗豁免指導(dǎo)原則》,該原則應(yīng)用于仿制藥物申請人體生物利用度和生物等效性實驗豁免[2]。根據(jù)藥物的溶解性和滲透性,藥物在BCS分類下有四類:Ⅰ類(高溶解性-高滲透性)、Ⅱ類(低溶解性-高滲透性)、Ⅲ類(高溶解性-低滲透性)、Ⅳ類(低溶解性-低滲透性)[3]。當口服固體制劑具有很高的溶解度,且在體內(nèi)的溶出時間比胃排空時間短時,藥物在體內(nèi)的吸收就不會依賴藥物的溶出時間和在胃腸道內(nèi)的停留時間。對于高溶解性的藥物,若藥物的吸收不被處方中輔料顯著影響,可免去藥物的人體生物利用度和生物等效性實驗,即滿足人體生物等效性實驗豁免的條件。

拉米夫定為核苷類似物,是乙型肝炎病毒的治療藥物,同時也可聯(lián)合齊多夫定用于治療艾滋病[4-6]。口服后其體內(nèi)的活性代謝物——拉米夫定三磷酸鹽作為逆轉(zhuǎn)錄酶的競爭性抑制劑,會影響乙型肝炎病毒DNA的復(fù)制,引起鏈終止[7-8]。拉米夫定對人體DNA聚合酶的親和力很低,因此不干擾人體正常的DNA合成[9-10]。拉米夫定在體內(nèi)有良好的吸收,據(jù)報道其口服生物利用度超過80%,且藥動力學(xué)特征呈現(xiàn)線性動力學(xué)過程,只有5%～10%的拉米夫定被代謝為無藥理活性的反式亞砜代謝物,70%左右的拉米夫定以原形式通過腎臟消除,在肝臟中的代謝很少[11-13]。拉米夫定溶解性高,若能通過合理的實驗研究其滲透性,得到其腸道滲透性數(shù)據(jù),則可以判斷其是否滿足生物等效性豁免[14]的條件。

在研究化合物腸道滲透性的諸多模型中,在體單向腸灌流模型保留了腸道神經(jīng)和轉(zhuǎn)運蛋白的完整性、血液及淋巴液的供應(yīng),較接近機體內(nèi)的狀態(tài)[15]。該模型簡單、準確,可用于預(yù)測腸道對藥物的吸收[16]。筆者使用在體單向腸灌流模型研究拉米夫定在大鼠腸道內(nèi)的滲透性,判定拉米夫定的BCS類別并為其申請人體生物等效性豁免提供有效、可靠的滲透性數(shù)據(jù)支撐。

1 實驗

1.1 藥品與試劑

拉米夫定(批號為DBH010G-B15B-171003,純度為99.8%),由福建廣生堂藥業(yè)股份有限公司提供;拉米夫定對照品(批號為101007-20150,純度為99.7%)、苯妥英鈉對照品(批號為100210-201303,純度為99.9%)和阿昔洛韋對照品(批號為100121-201104,純度為99.8%),購自中國食品藥品檢定研究院;人工小腸液(批號為0706A18)和人工胃液(批號為0920A18),購自北京雷根生物公司;水為自制超純水;其余試劑皆為分析純。

1.2 動物

無特定病原體級(SPF)SD大鼠30只,雌雄各半，體質(zhì)量大于300 g,由浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,生產(chǎn)許可證號為SCXK(浙)2018-0001,合格證號為1806130011。動物依據(jù)體質(zhì)量隨機分為5組,分別為苯妥英鈉對照組,阿昔洛韋對照組和拉米夫定高、中、低3個劑量組,每組6只,雌雄各半。

實驗大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)期一周期間自由進食、飲水。本實驗通過江蘇省藥物安全性評價中心實驗動物中心動物倫理委員會的批準。

1.3 儀器

LC-15C型高效液相色譜儀(HPLC)、SPD-15C檢測器,日本Shimadzu公司;BT100SV2-CE型蠕動泵,保定雷弗流體科技有限公司;F3JN77433型超凈水機,美國Millipore公司;XS105型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;5424型高速離心機,Eppendorf(中國)有限公司;基本型渦旋混合器,美國Talboys公司。

1.4 溶液的配制

1.4.1 Krebs-Ringer’s(K-R)溶液的配制

依次取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaH2PO4·2H2O 0.32 g、葡萄糖1.40 g、MgCl20.02 g、NaHCO31.37 g,置于1 L超純水中溶解,用H3PO4調(diào)節(jié)pH至6.8(每次臨用時現(xiàn)配)。

1.4.2 空白灌流液的制備

取1.4.1節(jié)中配制的K-R溶液,經(jīng)大鼠腸道灌流后,離心取上清液,即得空白灌流液。

1.4.3 拉米夫定標準儲備液的配制

精密稱取拉米夫定對照品10 mg,置于10 mL容量瓶中,加入甲醇與水(體積比為1∶1)溶解并定容,得到1 mg/mL的拉米夫定標準儲備液,冷藏于冰箱(4 ℃)中備用。

1.4.4 標準曲線系列溶液的配制

取1.4.3節(jié)配制的儲備液適量,用空白灌流液稀釋至拉米夫定質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1、2.5、5、10和25 μg/mL的系列溶液,即為標準曲線系列溶液。

1.4.5 含藥灌流液的配制

精密稱取拉米夫定供試品300 mg,置于250 mL容量瓶中,加適量K-R溶液使其完全溶解后定容,得到拉米夫定質(zhì)量濃度為1 200 μg/mL的含藥灌流液,作為灌流的高劑量組,再分別稀釋10倍和100倍后作為灌流的中(120 μg/mL)、低(12 μg/mL)劑量組。

精密稱取苯妥英鈉7.5 mg,置于250 mL量瓶中,加適量K-R溶液,振蕩使其溶解后,再加K-R溶液稀釋至刻度,制成含苯妥英鈉30 μg/mL的灌腸溶液。

精密稱取阿昔洛韋12 mg,置于100 mL量瓶中,加適量K-R溶液,振蕩使其溶解后,再加K-R溶液稀釋至刻度,制成含阿昔洛韋120 μg/mL的灌腸溶液。

1.5 檢測條件

檢測拉米夫定的色譜柱為Xterra MS C18型柱(2.1 mm×150 mm,5 μm),流動相為25 mmol/L醋酸銨-甲醇緩沖溶液(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3.8,醋酸銨與甲醇的體積比為85∶15),流速為0.15 mL/min,進樣體積為10 μL,柱溫為室溫,檢測波長為277 nm。

檢測苯妥英鈉的色譜柱為Venusil XBP C18型柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為20 mmol/L KH2PO4-乙腈緩沖溶液(用H3PO4調(diào)節(jié)pH至2.5,KH2PO4與乙腈體積比為60∶40),檢測波長為220 nm,流速為1.0 mL/min,進樣體積為10 μL,柱溫為室溫。

檢測阿昔洛韋的色譜柱為Venusil XBP C18型柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為甲醇-水(體積比為10∶90),檢測波長為254 nm,流速為1.0 mL/min,進樣體積為10 μL,柱溫為室溫。

1.6 大鼠在體單向腸灌流實驗[17-18]

1.6.1 大鼠在體單向腸灌流模型的建立

實驗前取禁食12 h但不禁水的SD大鼠,腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)麻醉后沿腹中線切口4 cm，打開腹腔,在腸道兩端插硅膠管,用滅菌的手術(shù)線固定,近心端作為灌流入口,遠端作為出口。實驗時，用等滲生理鹽水浸漬的紗布覆蓋于腸組織表面以保濕,于紅外燈下使大鼠保持正常體溫。先用37 ℃等滲生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物直至出口處溶液變清澈,然后用預(yù)熱至37 ℃的含藥灌流液進行灌流,灌流速率為0.2 mL/min,預(yù)平衡30 min后,入口處用已知質(zhì)量的裝有含藥灌流液的小瓶進行灌流,在出口處用另一已知質(zhì)量的小瓶收集灌流液(每隔20 min為一個灌流時間點,同時迅速更換下一個已知質(zhì)量的含藥灌流液小瓶和收集液小瓶),稱量后計算灌入和收集的藥液質(zhì)量,灌流時間持續(xù)至110 min。灌流結(jié)束后麻醉處死大鼠并測量灌流腸道的長度(l)和內(nèi)徑(r)。

1.6.2 模型驗證

采用高滲透性模型藥品(苯妥英鈉對照品)與低滲透性模型藥品(阿昔洛韋對照品)在所建模型上進行在體吸收參數(shù)的測定,在與高、低滲透性藥物的吸收參數(shù)作比較后,若發(fā)現(xiàn)兩者實驗數(shù)據(jù)符合要求,說明已建模成功。

1.6.3 拉米夫定大鼠在體單向腸灌流實驗

按1.6.1節(jié)方法進行拉米夫定高、中、低3個劑量組大鼠在體單向腸灌流實驗,灌流時間持續(xù)至110 min。

1.7 大鼠腸道灌流樣品的處理

取適量大鼠腸灌流樣品,以轉(zhuǎn)速16 000 r/min離心2 min后,取上清液,低劑量組直接進樣分析,中、高劑量組分別稀釋10倍和100倍后進樣分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理

(1)

(2)

(3)

式中:Q為腸道灌流的流速(0.2 mL/min)。

2 結(jié)果與討論

2.1 拉米夫定分析方法的驗證結(jié)果

2.1.1 專屬性

分別取空白灌流液、對照樣品(空白灌流液中添加10 μg/mL拉米夫定)和拉米夫定灌流樣品(10 μg/mL拉米夫定大鼠灌流液)進樣分析,HPLC圖譜見圖1。由圖1可知:在實驗條件下,拉米夫定的保留時間為5.785 min,空白灌流液在拉米夫定出峰處未檢出雜峰,分析方法特異性良好。

圖1 拉米夫定的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectra of lamivudine

2.1.2 線性關(guān)系

取標準曲線系列樣品進樣分析,記錄HPLC圖譜,以拉米夫定的色譜峰面積為縱坐標(y)、拉米夫定的質(zhì)量濃度為橫坐標(x),進行線性回歸運算,得到標準曲線的回歸方程為y=204 501x+8 297.1(相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9),拉米夫定質(zhì)量濃度的線性范圍為0.25～25 μg/mL。

2.1.3 稀釋可靠性

取拉米夫定標準儲備液,用空白灌流液稀釋,配制拉米夫定質(zhì)量濃度分別為120、1 200 μg/mL的溶液各5份,分別稀釋10倍和100倍后進樣分析，記錄HPLC峰面積,以HPLC峰面積計算拉米夫定質(zhì)量濃度并計算準確度。得到稀釋后的準確度為98%～102%,相對標準偏差(RSD)<1%,表明稀釋可靠性符合研究要求。

2.1.4 進樣精密度

取拉米夫定標準儲備液,用空白灌流液稀釋,配制拉米夫定質(zhì)量濃度為12 μg/mL的樣品溶液，連續(xù)進樣6次,考察進樣精密度,HPLC峰面積與保留時間的RSD分別為0.3%和0.1%,表明進樣精密度符合研究要求。

2.1.5 精密度與準確度

取拉米夫定標準儲備液,用空白灌流液稀釋,配制拉米夫定質(zhì)量濃度分別為2.5、12、20 μg/mL的低、中、高濃度樣品溶液,每一濃度樣品同日內(nèi)連續(xù)測定5次,把測得的HPLC峰面積代入標準曲線計算得到拉米夫定質(zhì)量濃度，并計算其RSD以考察批內(nèi)精密度,同法連續(xù)測定3 d以考察批間精密度;配制上述質(zhì)量濃度樣品各5份并進樣分析,將樣品的HPLC峰面積代入標準曲線中計算拉米夫定質(zhì)量濃度,以實驗濃度與理論濃度的比值計算回收率并作為準確度,結(jié)果見表1。批內(nèi)和批間精密度的RSD均小于2%,得到的回收率為98%～102%,均符合研究要求。

表1 精密度與準確度的實驗結(jié)果Table 1 Experimental results of precision and accuracy

2.1.6 穩(wěn)定性

取拉米夫定標準儲備液添加至空白灌流液中配制低、中、高濃度樣品溶液。拉米夫定在空白灌流液中于室溫下放置0、0.5、1、4、8、12和24 h后進樣分析,以HPLC峰面積計算拉米夫定的質(zhì)量濃度,結(jié)果見表2。由表2可知:拉米夫定在不同介質(zhì)和不同考察時間點質(zhì)量濃度的RSD均小于5%,拉米夫定在空白灌流液中的穩(wěn)定性良好。

表2 拉米夫定在空白灌流液中的穩(wěn)定性Table 2 Stability of lamivudine in blank perfusion

2.1.7 拉米夫定在人工胃液和人工腸液中的穩(wěn)定性

取拉米夫定標準儲備液添加至人工胃液和人工腸液中配制低、中、高濃度樣品溶液。拉米夫定在人工胃液中的考察時間點為37 ℃下放置0、0.2、1、1.5和2 h;拉米夫定在人工腸液中的考察時間點為37 ℃下放置0、0.83、1.17、1.5、1.83、4、6、8和10 h。以HPLC峰面積計算拉米夫定的質(zhì)量濃度,結(jié)果分別見表3和4。由表3和4可知:拉米夫定在不同介質(zhì)和不同考察時間點的質(zhì)量濃度的RSD均小于5%,拉米夫定在人工胃液和人工腸液中的穩(wěn)定性良好。

表3 拉米夫定在人工胃液中的穩(wěn)定性Table 3 Stability of lamivudine in artificial gastric juice

表4 拉米夫定在人工腸液中的穩(wěn)定性Table 4 Stability of lamivudine in artificial intestinal fluid

2.2 對照藥物的方法驗證結(jié)果

對照藥物苯妥英鈉和阿昔洛韋的驗證內(nèi)容包括專屬性、標準曲線、準確度、精密度和灌流液穩(wěn)定性。對照藥物在1.5節(jié)所述檢測條件下,苯妥英鈉的保留時間為4.732 min,阿昔洛韋的保留時間為7.295 min,空白灌流液在對照藥物出峰處未檢出雜峰,表明色譜方法特異性良好。對照藥物在0.25 ～ 25 μg/mL的范圍內(nèi)保持良好的線性關(guān)系,苯妥英鈉的標準曲線方程為y=19 532x-3 512.2(R2=1.000 0),阿昔洛韋的標準曲線方程為y=35 329x+1 169.8(R2=1.000 0);對應(yīng)的準確度為98% ～ 101%,RSD均小于1%;對應(yīng)的灌流液穩(wěn)定性分別為98.73%和99.88%。驗證結(jié)果均符合研究要求。

2.3 大鼠在體單向腸灌流模型的驗證結(jié)果

2.4 拉米夫定大鼠在體單向腸灌流實驗結(jié)果

表5 拉米夫定在大鼠腸道的吸收參數(shù)Table 5 Lamivudine absorption parameters in rat intestine

表6 拉米夫定在不同時間點的吸收參數(shù)Table 6 Lamivudine absorption parameters at different time points

拉米夫定片劑單次口服最高劑量為300 mg,溶于250 mL水中后,質(zhì)量濃度為1 200 μg/mL,因此,筆者選擇此質(zhì)量濃度作為研究拉米夫定腸道吸收的高劑量組濃度,稀釋10倍和100倍后分別作為中劑量組和低劑量組。實驗結(jié)果顯示,拉米夫定在大鼠腸道內(nèi)的吸收參數(shù)在各劑量組間無顯著性差異。

本實驗結(jié)果顯示拉米夫定的Peff為0.3×10-5～2×10-5cm/s,拉米夫定在腸道內(nèi)的吸收介于高滲透性和低滲透性之間,屬于中滲透性藥物,預(yù)計其口服固體制劑的人體吸收分數(shù)為50%～84%。拉米夫定藥動學(xué)研究顯示其在體內(nèi)快速吸收且口服的生物利用度大于80%,接近BCSⅠ類藥物的邊界,本實驗中拉米夫定的Peff也接近2×10-5cm/s。根據(jù)拉米夫定的溶解性資料,結(jié)合本實驗結(jié)果,拉米夫定屬于BCS Ⅲ類化合物[21]。對于活性成分為拉米夫定的仿制制劑,只要處方中的其他輔料成分不顯著影響拉米夫定的吸收,就不必證明該拉米夫定在體內(nèi)生物利用度和生物等效的可能性,即視為滿足生物等效性豁免的條件。

3 結(jié)論

1)本實驗建立的HPLC-UV分析方法，驗證專屬性、精密度、準確度和穩(wěn)定性均符合研究要求,可用于灌流樣品中拉米夫定的分離檢測。

3)不同劑量組拉米夫定在大鼠腸道內(nèi)及不同灌流時間點的吸收參數(shù)間無顯著性差異(P>0.05),拉米夫定存在被動擴散的吸收機制。