黎嬌凌， 陳 菊， 李玉紅

(黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院， 貴州 都勻 558000)

菝葜(SmilaxchinaL.)又名金剛藤，金剛果，鐵菱角，為菝葜科(Smila caceae)菝葜屬(SmilaxL.)攀援灌木。菝葜為常用中藥材，以根莖入藥、具有祛風(fēng)濕、利小便、消腫毒的功效，用于治療外科急性感染(癤、癰、蜂窩組織炎)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、癌腫等[1]。被廣泛用于治療婦科疾患、關(guān)節(jié)疼痛、肌肉麻木、痢疾、水腫、淋病、疔瘡、腫毒、痔瘡等癥[2]。應(yīng)用菝葜研制的金剛藤糖漿和金剛藤膠囊是我國(guó)治療婦科病的品牌良藥[3-4]。此外，菝葜的果色紅艷，嫩芽鮮紅(可食用)，樹形優(yōu)美，葉形奇特，耐寒性強(qiáng)等，可用于攀附巖石、 假山，也可作地面覆蓋，是一種良好的觀賞植物，可以作為南方地區(qū)立體綠化樹種[5]。張晨曦[6]研究表明，菝葜葉提取物有較強(qiáng)的抑菌作用，為增加菝葜的應(yīng)用價(jià)值提供了理論依據(jù)。菝葜主要靠自然分蘗或?qū)嵣敝?，但分蘗能力及種子發(fā)芽率低，扦插和嫁接較難成活[7]，且其藥用部位為其繁殖部位根莖。因野生資源破壞嚴(yán)重，為了更好地開發(fā)利用這一野生資源，有不少研究者對(duì)菝葜開展了研究，大多數(shù)研究集中在菝葜的種質(zhì)資源調(diào)查、化學(xué)成分、主要成分的提取及分析方法和藥理作用[8-9]，僅有少數(shù)幾個(gè)研究了菝葜的組織培養(yǎng)技術(shù)[10-11]，但繁殖率較低。為了優(yōu)化菝葜的組織培養(yǎng)技術(shù)體系，提高菝葜組織培養(yǎng)效率，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同方法研究菝葜叢生芽的誘導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

以采自都勻斗篷山野生菝葜的幼嫩莖段和帶芽根狀莖為實(shí)驗(yàn)材料。

1.1.2試 劑

MS培養(yǎng)基(不含瓊脂和蔗糖)、瓊脂粉均為化學(xué)純，購(gòu)于青島海博技術(shù)有限公司；蔗糖為西隴牌分析純?cè)噭?-BA，IBA，NAA均購(gòu)于上海藍(lán)秀生物科技公司生產(chǎn)的規(guī)格為1 g，BR級(jí)試劑。

1.2 方 法

1.2.1不同消毒方法

外植體采用菝葜當(dāng)年生枝條，經(jīng)預(yù)處理后切成約2 cm長(zhǎng)帶芽節(jié)段置超凈工作臺(tái)上用75%的酒精浸泡30 s、45 s后分別在0.1%的升汞溶液中浸泡3 min、5 min、7 min和9 min。然后用無(wú)菌水沖洗5次，每次1 min。最后去除外植體基部被消毒劑浸泡的部位，并留取約1.5 cm接種于培養(yǎng)基中。

1.2.2不同激素配比

采用當(dāng)年生帶芽莖段、莖尖及帶芽根狀莖，預(yù)處理后在75%的酒精中浸泡30 s，在0.1%的升汞水溶液中浸泡7 min。然后用無(wú)菌水沖洗5次(每次1 min)后，無(wú)菌接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以MS為基本培養(yǎng)基，并添加不同濃度的6-BA、NAA和IBA(具體濃度處理見表2)。蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，pH值5.8。

1.2.3不同外植體

采用當(dāng)年生帶芽莖段、莖尖及帶芽根狀莖，預(yù)處理后在75%的酒精中浸泡30 s，在0.1%的升汞水溶液中浸泡7 min。然后用無(wú)菌水沖洗5次(每次1 min)后，無(wú)菌接種于MS+6-BA(2 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)培養(yǎng)基中。

1.2.4不同防褐化處理

外植體在預(yù)處理之后，分別在抗壞血酸(0.5 g·L-1)、PVP(2 g·L-1)、半胱氨酸(0.1 g·L-1)中浸泡20 min，以不浸泡為對(duì)照處理。在75%的酒精中浸泡30 s，在0.1%的升汞水溶液中浸泡7 min。然后用無(wú)菌水沖洗5次(每次1 min)后，無(wú)菌紙吸干水分后接種于MS+6-BA(2 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)培養(yǎng)基中。

1.2.5不同季節(jié)、時(shí)期取材

分別在春、夏、秋季取當(dāng)年生枝條，枝條經(jīng)預(yù)處理后切成約2 cm長(zhǎng)帶芽節(jié)段，用PVP(2 g·L-1)浸泡20 min后于超凈工作臺(tái)上用75%酒精短時(shí)浸泡30 s，然后用0.1%升汞溶液處理7 min，用無(wú)菌水沖洗5次，每次1 min。去除外植體基部被消毒劑浸泡的部位并留取約1.5 cm接種于MS+6-BA(2 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)培養(yǎng)基上。

所有處理經(jīng)洗衣粉水浸泡5 min，流水下沖洗2 h后，每處理按10個(gè)芽，重復(fù)3次，于(25±2)℃，光照強(qiáng)度1 500～3 000 lx，每天光照12 h。培養(yǎng)第15天、第25天各記錄一次，第30天后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時(shí)間對(duì)外植體污染率的影響

不同消毒劑和消毒時(shí)間對(duì)外植體的影響較大。正確選擇消毒劑的濃度和處理時(shí)間可以降低污染率，盡量減少組織死亡，提高外植體的萌發(fā)率。具體結(jié)果見表1。

表1 不同消毒處理對(duì)菝葜叢生芽誘導(dǎo)的影響Table 1 Effects of different disinfection treatments on the induction of cluster buds of S. china

從表1可以看出，處理4的污染率最低，并與處理1、2、6差異顯著，且芽的萌發(fā)率也最低，與其他5個(gè)處理均達(dá)顯著差異；而處理2、3、5的污染率也很低，綜合3種處理的萌發(fā)率可知，處理2的萌發(fā)率最高，并與處理3、5達(dá)顯著差異。因此，菝葜帶芽莖段最佳消毒方式是75%酒精浸泡30 s，然后用0.1%升汞溶液處理7 min。

2.2 不同激素配比對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響

在MS基本培養(yǎng)基上，選用6-BA、NAA和IBA共3種植物激素，9種組合處理。 3種不同激素配比培養(yǎng)基對(duì)菝葜的誘導(dǎo)影響結(jié)果見表2。從表2可以看出，發(fā)芽率最高的分別是處理5、6、8，與其他處理均達(dá)到顯著差異。其中處理8的發(fā)芽率最高，但是芽扭曲畸形，而處理5的芽較處理6長(zhǎng)勢(shì)好，綜合比較處理5對(duì)菝葜的叢生芽誘導(dǎo)效果最好。因此,菝葜叢生芽誘導(dǎo)的最佳配方為MS+6-BA(2 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)。

表2 不同激素配比對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of different hormone ratios on the induction of cluster buds of S. china

2.3 不同外植體叢生芽誘導(dǎo)

同一種植物不同部位外植體的叢生芽萌發(fā)能力不一樣，通過(guò)不同外植體實(shí)驗(yàn)研究最適合的外植體，具體結(jié)果見表3。

接種后的第15天統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，莖尖芽萌發(fā)的速度最快，莖段芽萌發(fā)的速度稍慢而根狀莖最慢。第30天后的結(jié)果(表3)顯示，帶芽莖段、莖尖都能有效誘導(dǎo)叢生芽，兩者無(wú)顯著差異，且叢生芽生長(zhǎng)情況較好，其中莖尖的萌發(fā)率最高，但是帶芽莖段最易獲得，且萌發(fā)的芽全部發(fā)育成叢生芽；莖尖一個(gè)枝條只有一個(gè)而且并不是所有的芽全部發(fā)育為叢生芽；根狀莖前期易褐化而影響萌發(fā)，因此發(fā)芽率很低，與莖段和莖尖的萌發(fā)率差異顯著，芽萌發(fā)后長(zhǎng)勢(shì)也一般且材料不易獲得。綜上，菝葜叢生芽誘導(dǎo)的最佳外植體是帶芽莖段。

表3 不同外植體叢生芽誘導(dǎo)比較Table 3 Comparison of multiple shoots induction from different explants

2.4 幾種防褐化處理對(duì)外植體褐變的影響

菝葜外植體接種后易褐化，影響萌發(fā)甚至導(dǎo)致死亡，用3種不同防褐化劑處理后結(jié)果見表4。從表4可以看出，3種處理的褐化率都低于對(duì)照并達(dá)到顯著水平，對(duì)降低外植體的褐變率有明顯的作用。其中以PVP(2 g·L-1)浸泡的效果較為明顯，褐變率最低且與其他處理均達(dá)到顯著差異。

表4 不同外植體預(yù)處理防褐化比較Table 4 Pretreatment comparasion of different explants against browning

2.5 不同季節(jié)取材對(duì)萌發(fā)率和污染率的影響

在菝葜新生枝條的春季和生長(zhǎng)旺盛季節(jié)的夏、秋季取外植體，結(jié)果表明，春季取材的外植體叢生芽的萌發(fā)率最高，污染率最低，且達(dá)到顯著差異。因此，最佳的取材季節(jié)為春季。具體見表5。

表5 不同季節(jié)取材處理Table 5 Comparison of sampling and treatment in different seasons

3 討論與結(jié)論

菝葜的外植體相對(duì)比較光滑，因此在外植體的預(yù)處理和消毒滅菌中，采用比較常規(guī)的方式就能取得很好的效果。

菝葜根狀莖含有較多的多酚化合物，在培養(yǎng)過(guò)程中較易褐化影響其萌發(fā)率。而且根狀莖是菝葜藥用的主要部位，因此不建議作為組培快繁的外植體。菝葜幼嫩莖段在組培中也同樣容易褐化，從而影響其萌發(fā)率。采取一些防褐化處理能大大降低其褐化率從而提高外植體的成活率。

植物內(nèi)源激素的調(diào)控是叢生芽成功誘導(dǎo)的重要因素。外植體組織中內(nèi)源激素水平不同，引起培養(yǎng)基中最適外源生長(zhǎng)物質(zhì)濃度的變化[11]。因此，不同植物的組織培養(yǎng)有不同生長(zhǎng)物質(zhì)種類及濃度的需要。在菝葜叢生芽誘導(dǎo)試驗(yàn)中，適當(dāng)?shù)姆至阉睾蜕L(zhǎng)素濃度對(duì)菝葜叢生芽的分化有很大的影響。配比過(guò)低不利于叢生芽的誘導(dǎo)萌發(fā)，配比過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致叢生芽產(chǎn)生畸形影響其生長(zhǎng)，這與梁崇等[12]研究同屬植物土茯苓的結(jié)果一致。生長(zhǎng)素NAA對(duì)于叢生芽的誘導(dǎo)效果要優(yōu)于IBA。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分裂素只用了一種，兩種細(xì)胞分裂素共同作用是否更有利于菝葜叢生芽的誘導(dǎo)有待進(jìn)一步研究。

圖1 菝葜叢生芽培養(yǎng)過(guò)程Fig.1 Cultivation proces of multiple shoots of S. china

在菝葜生長(zhǎng)最為旺盛的夏、秋兩季，夏季由于溫度較高，其他有害微生物的繁殖速度也較快，因此容易污染從而影響發(fā)芽率；秋季可能由于其體內(nèi)的有效物質(zhì)積累到了較高水平，因此酚類物質(zhì)的含量也較多，外植體易褐化從而影響其成活率。

本研究表明，菝葜叢生芽誘導(dǎo)的最佳方法為：以菝葜帶芽莖段為外植體、用洗衣粉水浸泡5 min，流水下沖洗2 h后用PVP(2 g·L-1)浸泡20 min，然后于超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡30 s，0.1%升汞處理7 min后無(wú)菌水清洗5次。接種于MS+6-BA(2 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1培養(yǎng)基中。于光照強(qiáng)度1 500～3 000 lx(每天光照12 h)，25 ℃下培養(yǎng)。