汪玉玲，宋希強，郭向陽，王洪星，郭梨錦

（海南大學 熱帶特色林木花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室/林學院，?？?570228）

文心蘭（Oncidium hybridum）在栽培過程中易受各種病原菌的侵害[1]，如炭疽病。炭疽病主要由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起。在炭疽病發(fā)病初期，文心蘭葉片上產(chǎn)生淡褐色凹陷的小斑點后變大，病斑顏色由淡褐色轉(zhuǎn)成褐色最后成黑褐色，后期病斑處形成黑色小顆粒體，高濕度時可溢出粉紅色黏狀物的分生孢子堆，受光照影響而常呈輪紋狀[2]。文心蘭炭疽病影響文心蘭的產(chǎn)量和品質(zhì)及其經(jīng)濟價值。目前文心蘭炭疽病的防治主要通過噴灑化學藥劑，但此防治方法易造成農(nóng)藥殘留和使病原菌產(chǎn)生耐藥性等問題[3]。生物防治是利用了生物物種間的相互關系，以一種或一類生物防治另一種或另一類生物。與施用化學藥劑相比，生物防治具有對環(huán)境友好、綠色、無公害且不易誘導病原菌產(chǎn)生耐藥性、對病原菌有高度特異性等優(yōu)點[4-5]。篩選新型生防菌株以及研究其抗菌物質(zhì)已成為目前的研究熱點。芽孢桿菌屬是應用較廣泛的生防菌，能有效防控病害（如炭疽病、褐斑病、莖腐病等）[6-7]。目前關于生防菌在文心蘭上應用的研究較少，其拮抗機制尚不明確。本研究從健康文心蘭葉片分離出1株具有潛在廣譜拮抗活性的內(nèi)生菌菌株WB75。筆者研究WB75對文心蘭主要致病菌的廣譜性防效，并通過16S rDNA、gyrA和gyrB等基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定其分類地位，以期獲得能有效防控文心蘭炭疽病的菌株，為文心蘭炭疽病及其他多種病害的生物防治提供優(yōu)良的拮抗菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料試驗材料為海南博大蘭花科技有限公司文心蘭產(chǎn)業(yè)園區(qū)的文心蘭“博大1號”品種；供試內(nèi)生菌菌株WB75分離自健康文心蘭“博大1號”植株。供試病原真菌: 膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)；熱帶生炭疽菌(Colletotrichum tropicicola)；鷹嘴豆枯萎鐮刀菌(Fusarium delphinoides)；腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)；隔孢假殼科真菌(Paraconiothyrium thysanolaenae)；尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)；畫眉草彎孢菌(Curvularia eragrostidis)；芒果球座菌(Guignardia mangiferae)；巨座殼科真菌(Muyocopron alcornii)，這些病原真菌菌株均分離自文心蘭感病植株[8]，并保存于海南大學熱帶特色林木花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室。本實驗細菌的分離培養(yǎng)采用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的L B培養(yǎng)基；真菌的分離培養(yǎng)采用青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PDA培養(yǎng)基。

1.2 拮抗文心蘭炭疽病菌株的抑菌率平板對峙法：用滅過菌的打孔器（內(nèi)徑5 mm）將病原菌（已活化）打成菌餅，用滅菌牙簽將其挑到平板中心，將內(nèi)生菌菌株WB75點接在距離平板中心約為3 cm處的四周，對照只接病原菌，將處理和對照置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照組病原菌長滿平板即結(jié)束實驗，并計算抑菌率[9]。抑菌率為對照與處理菌落之差占對照菌落直徑的百分比。

發(fā)酵液的制作：將2～3塊內(nèi)生菌菌株WB75菌餅放入200 mL LB液體培養(yǎng)基中，封好口后放在28 ℃180 r·min-1搖床上培養(yǎng)7 d，將發(fā)酵液10 000 r·min-1離心5 min，用5層滅菌紗布包住漏斗過濾離心后的發(fā)酵液3次。過濾后的發(fā)酵液一部分用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾獲得無菌發(fā)酵液；另一部分用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌30 min，得到高溫處理后的發(fā)酵液（高溫發(fā)酵液）。處理為發(fā)酵液（無菌發(fā)酵液或高溫發(fā)酵液）與PDA培養(yǎng)基的混合液體（體積比為1∶5），將2種含發(fā)酵液的培養(yǎng)基分別倒板，對照僅為PDA培養(yǎng)基。實驗重復3次，將打成菌餅的病原菌放在培養(yǎng)皿的中心，待對照組病原菌長滿平板，測量實驗組和對 照組菌落的直徑，計算抑菌率。

1.3 內(nèi)生菌致病性驗證驗證內(nèi)生菌的致病性：將內(nèi)生菌菌株進行活化，再用打孔器（內(nèi)徑5 mm）打成菌餅；取長勢一致的文心蘭無菌組培幼苗，接種在改良DE培養(yǎng)基中，每瓶3株；處理組為在培養(yǎng)7 d且無污染的組培苗中間放入1個內(nèi)生菌菌餅，對照組則放無菌的PDA菌餅；5個重復，用封口膜封口后放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)條件：光照/黑暗=14 h/10 h、光強40 μmol·m-2·s-1、溫度約25 ℃、相對濕度約75%。記錄苗的株高、根數(shù)、凈重等指標，定期觀察菌苗共生狀況，記錄是否致病或致死[10]。使用針刺法[11]接種細菌驗證其在文心蘭植株上的致病性。實驗采用博大蘭花科技有限公司提供的8月齡文心蘭盆栽苗，依次用75%酒精和無菌水消毒清洗葉片，晾干后在葉片正面采用一次性無菌針灸針輕微刺傷，每處傷口進行數(shù)次針刺（所占面積小于菌餅底面積），1片葉子上處理6～8處傷口，之后將菌餅貼于傷口之上，并將濕潤的無菌濾紙鋪在接種的葉片上保濕，對照接種相同大小的無菌PDA菌餅，處理設置3個重復。所有文心蘭 植株在28 ℃，相對濕度約60%的條件下培養(yǎng)，觀察并記錄葉片是否發(fā)病。

1.4 內(nèi)生菌菌株抑菌廣譜性的測定采用對峙培養(yǎng)法[12]，與熱帶生炭疽菌C.tropicicola、鷹嘴豆枯萎鐮刀菌F.delphinoides、腐皮鐮孢菌F. solani、隔孢假殼科真菌P. thysanolaenae、尖孢鐮刀菌F. oxysporum、畫眉草彎孢菌C.eragrostidis、芒果球座菌G. mangiferae、巨座殼科真菌M. alcornii共12株病原真菌進行 對峙培養(yǎng)，每個處理重復3次，方法與1.2相同。

1 .5 內(nèi)生菌菌株的分類鑒定

1.5.1 形態(tài)鑒定先將活化內(nèi)生菌菌株（LB 平板），轉(zhuǎn)入50 mL LB液體培養(yǎng)基中，在搖床（28℃ 150 r·min-1）上搖培24 h，取少量菌液稀釋后進行革蘭氏染色，菌液培養(yǎng)3～4 d后進行芽孢染色。內(nèi)生菌菌株在L B平板上培養(yǎng)3～4 d后觀察菌落形態(tài)等特征并拍照。

1 .5.2 生理生化鑒定內(nèi)生菌菌株生理生化鑒定用《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]中的方法。

1.5.3 分子生物學鑒定用細菌DNA 提取試劑盒提取內(nèi)生菌菌株基因組DNA，分別用細菌 16S rDNA通用引物[14]、gyrA[15]和gyrB基因[16]引物（表1）進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后交由華大基因有限公司測序，測序結(jié)果上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，以獲得序列登錄號[17]。所得序列在NCBI上 的 BLAST 進行相似性分析，系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap 1000）用MEGA7.0構(gòu)建（Neighbor-Joining法）。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequence

1 .6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)整理、繪畫分別采用Excel 2019和Origin 9.1軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的抑菌率前期分離得到內(nèi)生菌株WB75，以文心蘭炭疽病為指示菌，進行平板對峙實驗的抑菌率為（58.79±0.46）%（圖1-A），并對菌株WB75的發(fā)酵液進行抑菌測定，發(fā)酵液原液的抑制率為（77.69±3.79）%，高溫發(fā)酵液的抑制率下降至（41.26±4.08）%，呈現(xiàn)大幅下降現(xiàn)象，說明高溫對菌株WB75發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生較大影響。與對照組相比，實驗組膠孢炭疽菌菌絲均表現(xiàn)出了明顯被抑制的現(xiàn)象（圖1-C、E），暗示發(fā)酵液中含有豐富的抑菌活性物質(zhì)，抑制了菌絲生長。

圖1 菌株WB75對膠孢炭疽菌的抑制作用A： WB75與病原菌的平板對峙作用；C：WB75發(fā)酵原液抑菌；E：WB75高溫后發(fā)酵液抑菌；B、D、F：空白對照。Fig. 1 Inhibition effect of the endophyte strain WB75 on Colletotrichum gloeosporioidesA: The flatbed confrontation between WB75 and pathogenic fungi; C: Fungal inhibition of WB75 fermentation broth;E: Fungal inhibition in WB75 fermentation broth after high temperature; B, D, F: Blank control.

2.2 內(nèi)生菌菌株的無致病力測定將分離獲得的菌株WB75進行致病性測定，7 d 后觀察發(fā)現(xiàn)，刺傷接種與對照組接無菌PDA菌餅的傷口均無病斑產(chǎn)生。使用菌苗共生DE培養(yǎng)基，在組培苗中共生培養(yǎng)2 個月，植株未出現(xiàn)病癥現(xiàn)象。結(jié)果說明，菌株WB75對植物無致病性作用。

2.3 內(nèi)生菌抑菌廣譜性測定菌株WB75對不同病原菌的拮抗性表現(xiàn)如圖2 所示。菌株WB75對不同病原菌的抑制率（表2）分析結(jié)果表明，WB75對分離獲得的8種（熱帶生炭疽菌、 鷹嘴豆枯萎鐮刀菌、腐皮鐮孢菌、隔孢假殼科真菌、尖孢鐮刀菌、畫眉草彎孢菌、芒果球座菌、巨座殼科真菌）12株文心蘭病菌均有抑制作用，其中對F. solani的2株病原菌（WG1和WB23））抑制率超過80%，對WG1抑制作用最強，抑制率達到了91.53%；其次對WB23抑制率也達到82.79%，對7株病原真菌(W38、WB1、WB11、WB19、WB35、WB6和WG2)的抑制率超過50%。對W47、WG3和WG4的抑制效果差一些。

表2 菌株WB75對不同病原菌的抑制率Tab. 2 Inhibition rates of the endophyte strain WB75 against different pathogens

圖2 菌株WB75對不同病原菌的拮抗性表現(xiàn)A：腐皮鐮孢菌F. solani (WB11)；B：腐皮鐮孢菌F. solani (WB23)；C：腐皮鐮孢菌F. solani (WG1)；D：腐皮鐮孢菌F.solani (W47)；E：鷹嘴豆枯萎鐮刀菌F. delphinoides (WB6)；F：尖孢鐮刀菌F. oxysporum (W38)；G：尖孢鐮刀菌F. oxysporum(WB1)；H：芒果球座菌G. mangiferae (WB35)；I：隔孢假殼科真菌P. thysanolaenae (WG2)；J：畫眉草彎孢菌C. eragrostidis(WG3)；K：熱帶生炭疽菌C. tropicicola (WB19)；L：巨座殼科真菌M. alcornii (WG4)。左邊為WB75與病原菌的對峙圖，右邊為對照組病原菌。Fig. 2 Antagonism of the endophyte strain WB75 to different pathogenic fungiThe left side shows the confrontation between WB75 and pathogenic fungi, while the right side shows the control group.

利用十字交叉法每天測量病原菌直徑，繪制生長曲線（圖3）。發(fā)現(xiàn)菌株WB75對F. solani（WG1）和F. solani（WB23）的抑制作用在48～72 h達到峰值，對C. tropicicola（WB19）的抑制作用在72～96 h達到峰值，對F. oxysporum（WB1）、F. solani（WB11）、F. oxysporum（W38）的抑制作用在96～120 h達到峰值，對G. mangiferae（WB35）、P. thysanolaenae（WG2）、F. delphinoides（WB6）和F. solani（W47）的抑制作用在120～144 h達到峰值，病原菌將不再生長，而對照組仍無限生長。對C. eragrostidis（WG3）的抑制作用在144～168 h達到峰值，而對M. alcornii（WG4）的抑制效果相對較差，在144 h后增速下降，但相對于對照組，M.alcornii（WG4）在菌株WB75的影響下，仍有一定的抑制效果。試驗結(jié)果說明相同屬的一些菌株具有一些相似的性質(zhì)。

圖3 不同病原菌在菌株WB75拮抗下的生長速率Fig. 3 Growth rates of different pathogens under antagonism of the endophyte strain WB75

2 .4 內(nèi)生菌菌株的分類鑒定

2.4.1 內(nèi) 生 菌 菌 株 形 態(tài) 和 生 理 生 化 特 征在LB固體培養(yǎng)基上，菌株WB75呈乳白色，表面有皺褶，菌落粗糙且邊緣略顯不規(guī)則（圖4-A）。菌株WB75是革蘭氏陽性細菌，細胞呈短桿狀，單個或成對，極易成鏈狀（圖4-B），菌株WB75形態(tài)、革蘭氏染色、芽孢染色等顯示芽孢屬特征（圖4-C）。結(jié)合該菌株的生理生化特征（表3），參照《常見細菌系 統(tǒng)鑒定手冊》，判定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。

表3 菌株WB75的生理生化特性Tab. 3 Physio-biochemical characteristics of endophyte strain WB75

圖4 菌株WB75形態(tài)學鑒定A：菌株WB75菌落正面；B：革蘭氏染色；C：芽孢染色。Fig. 4 Morphological identification of the endophyte strain WB75A: The front side of endophyte strain WB75; B : Gram staining; C: Staining diagram of spore.

2.4.2 內(nèi)生菌菌株WB75的16S rDNA、gyrA、gyrB基因序列分析對菌株WB75的16S rDNA進行PCR擴增，得到長1 422 bp的PCR擴增產(chǎn)物。經(jīng)過與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫比對，其序列與解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens（NZCP05 3376.1）和貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis（NZCP011937.1）相似性較高（圖5-A）。菌株WB75的16SrDNA核苷酸序列已提交GenBank，登錄號為MW238381。用菌株WB75gyrA基因引物測定gyrA基因序列，獲得 943 bp 的基因片段，在NCBI上比對分析以后，發(fā)現(xiàn)其與解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens（NZCP053376.1）菌 株gyrA基因的一致性達到 99%以上（圖5-B）。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果（圖5-B）顯示，菌株WB75 與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）（NZCP053376.1）分支較近，支持率較高。用菌株WB75 的gyrB基因得到序列為 1 145 bp 的基因片段，與B. amyloliquefaciens（CP017953.1）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）（MH428832.1）以67%的支持率聚成同一分支（圖5-C），綜合3個基因的序列比對結(jié)果分析，說明菌株WB75是解淀粉芽孢桿菌。

圖5 內(nèi)生菌菌株的16s、gyrA、gyrB基因序列分析A. 16S 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹；B. gyrA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹；C. gyrB 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。Fig. 5 Sequence analysis of 16S, gyrA and gyrB genes of the endophyte strain WB75A. Phylogenetic tree division based on 16S gene sequence; B. Phylogenetic tree division based on gyrA gene sequence;C. Phylogenetic tree division based on gyrB gene sequence.

3 討 論

菌株 WB75對炭疽菌屬和鐮刀菌屬等13株病原真菌有38.42%～91.53%的抑制作用，對F. solani（WG1）腐皮鐮孢菌抑制作用最強，抑制率達到91.53%。通過形態(tài)觀察、生理生化特性以及分子生物學手段，菌株 WB75被鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

層出鐮刀菌引起蘭花葉斑病[18]，尖孢鐮孢菌引起墨蘭Cymbidium sinense莖腐病和建蘭Cymbidiumensifolium莖腐病[19]，引起蝴蝶蘭Phalaenopsis aphrodite莖腐病[20]，膠孢炭疽菌是墨蘭、大花蕙蘭Cymbidium hybrid和鐵皮石斛Dendrobium officinale炭疽病的病原菌[21]。本研究發(fā)現(xiàn)菌株WB75對以上鐮刀菌屬和炭疽菌屬均具有較好的拮抗效果。周平蘭等[22]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬能拮抗蘭花炭疽病病原菌。許文江等[23]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生枯草桿菌 FJAT-9 986 能防治蝴蝶蘭葉基腐病菌。王士燕等[24]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌拮抗膠孢炭疽菌、尖孢鐮孢菌和腐皮鐮孢菌3種蘭花病原真菌。本研究中，菌株WB75發(fā)酵液對病原真菌有很好的抑制效果，說明發(fā)酵液中存在抑菌活性物質(zhì)，但菌株發(fā)酵液經(jīng)過121℃高溫處理后抑制效果顯著下降，說明發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)不耐高溫，但121℃高溫處理后的菌株WB75發(fā)酵液仍能溶解病原真菌菌絲，可較好地抑制病原真菌。

芽孢桿菌屬是世界公認的生防菌，被廣泛應用于植物病害防治[25]。有研究表明解淀粉芽孢桿菌主要通過產(chǎn)生蛋白酶等生防相關酶和含有抗菌肽合成基因[26]、幾丁質(zhì)酶及嗜鐵素[27]等進行抑菌。解淀粉芽孢桿菌的廣譜抑菌性已有報道，能有效防治大白菜軟腐病菌和 8 種病原真菌[28]，能有效抑制黃瓜枯萎病并促進黃瓜植株生長[27]。芽孢桿菌的內(nèi)生芽胞，具有耐熱、耐干燥和抑菌能力強等優(yōu)點，且其生產(chǎn)工藝簡單，存儲期較長，是一種開發(fā)潛力很高的生防菌[29]。

本研究僅確定菌株WB75為解淀粉芽孢桿菌，且初判斷其具有一定生防潛力，但對其拮抗機理的研究不夠深入，對菌株發(fā)酵液含有的抑菌物質(zhì)的具體成分及其抑菌機理尚不明確，這些均有待進一步研究。菌株WB75對病原菌的室內(nèi)或田間防效試驗也有待進一步研究。

致謝：海南大學生態(tài)與環(huán)境學院丁瓊老師、植物保護學院劉銅老師對本實驗給予了指導與幫助，一并致謝！