鄧雅潔，劉云豪，孫 琪，邱 越，宋家明，賴杭桂

（海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，?？冢?70228）

木薯(Manihot esculentaCrantz)屬大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot），與馬鈴薯、甘薯并稱為世界三大薯類[1]。木薯從十九世紀初引入中國，廣泛種植于我國華南地區(qū)，現(xiàn)在已逐步發(fā)展到我國華東、華中、西南地區(qū)的多個省市[2]。木薯除了是主要的糧食作物，還可以作為經(jīng)濟及能源作物生產(chǎn)動物飼料、淀粉以及酒精等[3-5]。隨著木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展不斷壯大，木薯的育種目標不再單純地只為滿足產(chǎn)量和品質(zhì)上的基本要求，還需提升品種的抗逆性，并且已經(jīng)有專家發(fā)現(xiàn)多倍化可以增加木薯抗逆性[6-7]。木薯由于基因組高度雜合，使得后代出現(xiàn)嚴重的性狀分離，且木薯有12個月的種植周期，這就導(dǎo)致木薯通過傳統(tǒng)育種進行育種改良的過程漫長并具有挑戰(zhàn)性[8]，而多倍體育種可以縮短木薯的育種周期，故被廣泛應(yīng)用于木薯育種工作。多倍體具抗逆性強等優(yōu)點，可以滿足目前抗逆性品種選育的育種目標[9]。前人多通過體細胞染色體加倍獲得木薯無性四倍體，關(guān)于木薯有性多倍化的報道較少。近年來，有育種專家發(fā)現(xiàn)通過2 n配子誘導(dǎo)木薯有性多倍化可以使木薯同源染色體之間發(fā)生高頻率重組，從而讓親本的優(yōu)良基因發(fā)生間滲，達到優(yōu)良品種選育的目的[10-11]。關(guān)于木薯的有性多倍化研究從2010年才開始，LAI H等[12]觀察了木薯大孢子發(fā)生、雌配子體發(fā)育過程各時期與花序、雌蕊的外部形態(tài)的相關(guān)性；采用秋水仙素溶液棉浸法對木薯花芽進行誘導(dǎo)，比較分析了誘導(dǎo)后花序、雌花及子房的形態(tài)變異，并通過種間雜交得到首例木薯有性四倍體植株。

使用二維電泳(2-DE)和質(zhì)譜(MS)，通?？梢栽诮o定的組織或細胞樣品中可視化，定量和鑒定成百上千種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組分析也越來越多地用于功能性植物研究中[13]。蛋白質(zhì)水平分析有可能為植物對蛋白質(zhì)的脅迫反應(yīng)提供廣闊的視野[14]。一些報道集中于對植物多倍體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，包括香蕉[15]，馬鈴薯[16]，棉花[17]，小麥[18-19]等。由于對木薯有性多倍化的研究較少，所以關(guān)于木薯有性四倍體抗旱機制的研究報道也相對較少?，F(xiàn)有研究多從木薯長勢形態(tài)及各項生理指標來研究木薯的抗旱性，也有科研人員從基因組的水平研究木薯抗旱性，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下木薯出現(xiàn)表達差異的基因，但YIN等[20]的研究結(jié)果表明，蛋白組與基因組在逆境條件下，兩者的表達趨勢并不完全相同。有性多倍化由于起源于配子加倍，其倍性的遺傳穩(wěn)定性理論上要優(yōu)于組織器官加倍的無性多倍化途徑，即避免了混倍嵌合體現(xiàn)象。本研究在本課題組研究木薯有性四倍體后代株系且基本明確其具備遺傳穩(wěn)定性后，將木薯有性四倍體與其母本華南5號作為供試材料，初步觀察了供試材料株系在干旱脅迫下長勢、葉片形態(tài)等生長特性，并通過系統(tǒng)鑒定干旱脅迫下木薯葉片差異表達蛋白、研究與有性四倍體葉片抗旱機制相關(guān)的代謝通路，旨在為木薯抗旱性種質(zhì)資源開發(fā)提供科研依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料本實驗以有性四倍體木薯和華南5號（SC5）木薯為供試材料，對照材料為木薯華南5號。中國熱帶農(nóng)科院品資所為本實驗提供了供試材料的種質(zhì)資源，本課題組將其種植于海南大學(xué)儋州校區(qū)農(nóng)科基地(19°30′N ，109°28′E)培養(yǎng)。木薯有性四倍體通過華南5號（母本）和華南10號（父本）有性雜 交產(chǎn)生。

1.2 干旱脅迫處理設(shè)計本試驗于2017年在海南大學(xué)儋州校區(qū)農(nóng)學(xué)院溫室大棚進行。供試材料采用無性系扦插-盆栽營養(yǎng)土方式進行種植培養(yǎng)，選用的花盆規(guī)格為高15 cm，口徑22 cm，用于扦插的種莖要求長度在15 cm左右。待植株長到45 cm左右，對其中長勢一致的木薯進行干旱處理。干旱脅迫處理：設(shè) 置5，10，15 d干旱時間處理梯度；對照為正常澆水，每處理3次重復(fù)。

1.3 測定項目及方法經(jīng)干旱梯度處理下的供試木薯材料，擇其第四片功能葉，葉片除中脈以外部分剪成大小均一的碎葉，對其進行各項生理指標測定。采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定丙二醛含量，具體操作參照李合生[21]的方法；游離脯氨酸的測定采用磺基水楊酸提取法、茚三酮顯色法，具體操作參照《 植物生理生化實驗原理和技術(shù)》[22]；采用超氧化物歧化酶活性測定試劑盒測定SOD酶活性。

1.4 提取、分離及鑒定干旱處理下的木薯葉片全蛋白質(zhì)采用苯酚提取法[23]提取木薯葉片全蛋白質(zhì)，使用Bradford試劑盒對溶解的蛋白質(zhì)定量，再采用雙向電泳[23]對其分離，3次重復(fù)。使用Delta2D軟件對照華南5號葉片全蛋白質(zhì)圖譜分析確定有性四倍體木薯葉片的差異蛋白質(zhì)點，篩選并標記出表達量符合 平均差異表達量在±2.0以上要求的蛋白質(zhì)[24]。鑒定蛋白質(zhì)參照AN F等[13]的操作。

1.5 構(gòu)建木薯干旱脅迫下葉片差異蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)本研究對鑒定出的抗旱性相關(guān)的差異蛋白質(zhì)使用S tring分析軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）[25]。

1.6 數(shù)據(jù)處理本研究的所有數(shù)據(jù)均先使用Excel 2013軟件處理，后經(jīng)過SPSS軟件對處理后的數(shù)據(jù)進行 統(tǒng)計學(xué)分析，本研究圖片均采用Adobe Photoshop CC軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干旱處理木薯葉片形態(tài)的變化對供試材料在干旱脅迫5、10、15 d時的葉片形態(tài)進行拍照，以便于觀察不同干旱處理程度下木薯有性四倍體和華南5號葉片的變化。由圖1所示，隨著干旱脅迫程度的加深，植株生長日漸緩慢甚至趨于停止，葉片也呈現(xiàn)出自下而上干枯脫落的狀態(tài)。然而在同一干旱處 理程度下，有性四倍體植株長勢比華南5號好，葉片枯萎較SC5緩慢，能更好地適應(yīng)干旱脅迫。

圖1 SC5和有性四倍體干旱脅迫0～15 d的形態(tài)變化左：有性四倍體；右：SC5Fig. 1 Morphological changes of cassava SC5 and its sexual tetraploid after 0-15 d of drought stress Left: Sexual tetraploid; Right: SC5

2.2 不同干旱處理木薯葉片丙二醛含量、游離脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性變化木薯葉片丙二醛含量在不同干旱處理的變化如圖2所示，在干旱協(xié)迫下華南5號葉片中丙二醛含量極顯著地（P＜0.01）高于有性四倍體葉片的。有性四倍體與華南5號葉片中丙二醛含量隨著干旱脅迫程度加深均呈上升趨勢，華南5號上升趨勢更顯著。由上可知，有性四倍體的內(nèi)膜系統(tǒng)比華南5號能夠更迅速有效地響應(yīng)干旱脅迫，作出防御來減輕干旱對植株造成的傷害。

木薯葉片脯氨酸含量在不同干旱處理下的變化如圖3所示，經(jīng)干旱處理后，供試材料葉片中脯氨酸含量均增加，說明葉片中均通過積累脯氨酸來應(yīng)對外界不良環(huán)境，并且有性四倍體葉片中含量增加更顯著，隨著干旱處理程度加深，華南5號葉片中脯氨酸含量持續(xù)積累，有性四倍體葉片中脯氨酸含量呈先上升后下降趨勢。因此，推測在干旱處理5～10 d時，有性四倍體比華南5號更能迅速地積累更多的脯氨酸進行滲透調(diào)節(jié)，有效地響應(yīng)干旱脅迫；在干旱處理15 d時，有性四倍體已經(jīng)在前期通過滲透調(diào)節(jié)適應(yīng)干旱脅迫，而華南5號因為前期脯氨酸含量積累少不足以較快適應(yīng)干旱脅迫。

圖3 干旱脅迫下木薯有性四倍體和SC5葉片中脯氨酸含量的變化Fig. 3 Changes of the leaf content of proline in cassava sexual tetraploid and SC5 under drought stress

圖3 干旱脅迫下木薯有性四倍體和SC5葉片中脯氨酸含量的變化Fig. 3 Changes of the leaf content of proline in cassava sexual tetraploid and SC5 under drought stress

木薯葉片SOD活性在不同干旱處理下的變化如圖4所示，在干旱處理下，有性四倍體葉片中SOD活性極顯著地高于華南5號（P＜0.01），且隨著干旱處理時間延長，供試材料葉片中SOD活性均呈先 升后降趨勢，然而有性四倍體木薯葉片中超氧化物歧化酶活性變化較華南5號木薯的更明顯。

圖4 干旱脅迫下木薯有性四倍體和SC5葉片中SOD活性的變化Fig. 4 Changes of the activity of SOD in the leaves of cassava sexual tetraploid and SC5 under drought stress

2.3 干旱處理下木薯葉片的差異蛋白質(zhì)點對木薯有性四倍體和華南5號經(jīng)干旱處理后差異明顯植株的葉片全蛋白質(zhì)進行提取、分離、染色，得到重復(fù)性較好的葉片蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜（圖5A和5B）。使用Delta 2D軟件對照華南5號葉片全蛋白質(zhì)圖譜進行分析，確定有性四倍體木薯葉片的差異蛋白質(zhì)點，篩選并標記出34個表達量符合平均差異表達量在2.0倍[24]以上要求的蛋白質(zhì)點（圖5C），包括18個表達上調(diào)的蛋白質(zhì)，16個表達下調(diào)的蛋白質(zhì)。將上述蛋白質(zhì)比對差異蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜，再聯(lián)合NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)有29個與之相符的差異蛋白質(zhì)，并對其按作用分類，各蛋白質(zhì)詳細相關(guān)信息如表 1所示。

圖5 干旱脅迫后有性四倍體及SC5葉片雙向蛋白圖譜及其疊加圖A：有性四倍體木薯B：SC5（對照），C：疊加圖；黑色箭頭指示上調(diào)表達蛋白質(zhì)點，白色箭頭指示下調(diào)蛋白質(zhì)點Fig. 5 2-DE proteins images of sexual tetraploid and SC5 cassava’s leaf under drought treatmentA: Sexual tetraploid ; B: SC5 (control); C: Overlay image . Black arrows indicate proteins are up-regulated and white arrows indicate proteins down-regulated.

表1 干旱脅迫后有性四倍體與SC5葉片差異蛋白質(zhì)的統(tǒng)計Tab. 1 Identification of differentially expressed proteins extracted from the leaves of the sexual tetraploid and SC5 after drought stress

續(xù)表1 Tab. 1 continued

2.4 木薯干旱脅迫下葉片差異蛋白質(zhì)互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建差異蛋白質(zhì)點互作網(wǎng)絡(luò)如圖6所示，有13個蛋白質(zhì)節(jié)點、31種蛋白質(zhì)互作關(guān)系存在于差異蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中。各差異表達蛋白質(zhì)間通過多條通路進行調(diào)節(jié)，其線條的粗細代表蛋白質(zhì)相互作用的強弱，其中GS2蛋白質(zhì)點相互作用較強，且調(diào)節(jié)通路多達9條；RCA蛋白質(zhì)點含有7種互作關(guān)系；RBCS3B、PSBP-1及PSBO2蛋白質(zhì)均包括6種互作關(guān)系；T PI、CA1和RBCL蛋白質(zhì)有5種互作關(guān)系。

圖6 基于String軟件構(gòu)建的木薯葉片差異蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）不同顏色圓圈表示有不同生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)；兩蛋白質(zhì)點由線條連接表示其相互作用，線條粗細表示兩者之間相互作用的強弱；黑色箭頭代表表達上調(diào)；白色箭頭代表表達下調(diào).Fig. 6 Cassava Leaf Different Protein-Protein Interacting (PPI) Network Based on String Software Different color circles reprsent proteins with different biological functions; Two protein points are represented by line connections, and line weight indicates the strengh of the interaction between the two; black arrows represents upward expression,White arrows represents downward expression.

3 討 論

植物多倍體誘導(dǎo)會使其花、果實、葉片等器官增大，且對于逆境的抗性能力也會增強，如小麥[26]、玉米[27]、棉花[28]等植物的多倍體類型均具有比未加倍材料更強的抗逆性。并且，以往的研究表明[7]，木薯多倍體植株的解剖學(xué)改變，在薄壁組織細胞的密度、壓實度和厚度上存在差異，可使四倍體植株具有較高的耐旱性。四倍體中大量的容器群也可比二倍體中較少的容器群保持更多的水分[7,29]。丙二醛（MDA）含量、脯氨酸含量以及超氧化物歧化酶（SOD）活性是評價植物抗旱性的重要生理代謝變化指標，其中丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，已作為測量氧化損傷的指標被廣泛應(yīng)用[30-32]。其含量變化間接反映出植物的抗逆性，在相同水分脅迫下MDA含量的增幅差異, 說明品種間確實存在抗旱性差別，丙二醛(MDA) 含量增幅越少的品種抗旱性越強。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)干旱處理后華南5號葉片中丙二醛增量極顯著地高于有性四倍體。植物經(jīng)干旱處理后，其葉片中通過迅速積累脯氨酸進行滲透調(diào)節(jié)細胞含水量來提高植物的抗旱性[33-35]。據(jù)本研究結(jié)果推測：在干旱處理5～10 d時，木薯有性四倍體比華南5號更迅速地積累更多的脯氨酸進行滲透調(diào)節(jié)，有效地響應(yīng)干旱脅迫；在干旱處理15 d時，有性四倍體已經(jīng)在前期通過滲透調(diào)節(jié)適應(yīng)干旱脅迫。超氧化物歧化酶（SOD）是維持細胞膜的穩(wěn)定性的抗氧化酶，較高的SOD活性值能減輕膜脂過氧化對植物造成的傷害[36]。本研究結(jié)果顯示有性四倍體葉片中SOD活性極顯著地高于華南5號。上述生理指標數(shù)據(jù)都說明木薯有性四倍體的抗旱能力更強。

多倍體誘導(dǎo)對蛋白質(zhì)組影響被認為是顯著的，在干旱逆境過程木薯的蛋白質(zhì)表達量發(fā)生變化以適應(yīng)干旱環(huán)境。本研究基于String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建有性四倍體木薯葉片差異蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)光合作用類蛋白質(zhì)GS2相互作用較強，且調(diào)節(jié)通路最多。

在高等植物中核酮糖二磷酸羧化酶是由8個大亞基和8個小亞基組成的，其催化和活化部位都位于大亞基上，而小亞基與活性無關(guān)[37]。由于該酶能夠調(diào)節(jié)光合作用的碳同化速率，所以其活性高低是影響植物的凈光合產(chǎn)量的直接因素[36,38-39]。干旱脅迫會使酶活性降低，導(dǎo)致碳同化速率降低，從而影響光合速率，其表達量隨干旱程度加深而增加，進而減少干旱脅迫對植物造成的危害[40-42]。PARKER等[43]指出耐旱性向日葵在干旱脅迫下，葉片中Rubisco含量高于正常環(huán)境下的含量，這是一種植物對干旱環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)，也顯示出該植物較強的抗旱能力。本研究結(jié)果顯示，干旱條件下木薯有性四倍體葉片中Rubisco的表達量上調(diào)，因此，推測有性四倍體木薯在干旱條件下能更迅速地表現(xiàn)出適應(yīng)性反應(yīng)，以減少干旱環(huán)境對木薯造成的危害。

放氧增強蛋白是一種葉綠體蛋白，位于光系統(tǒng)Ⅱ (PSⅡ) 的邊緣，與放氧關(guān)系最密切[44]。放氧增強蛋白包括放氧增強蛋白1、放氧增強蛋白2、放氧增強蛋白3，其中放氧增強蛋白1、放氧增強蛋白2是影響氧釋放活力的重要影響因子[45]。放氧增強蛋白1通過作用于植物光合作用中氧氣釋放的過程來保證光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)正常。有研究表明放氧增強蛋白是植物遭受逆境脅迫時光合相關(guān)蛋白的降解產(chǎn)物[45]。本研究木薯葉片的差異蛋白質(zhì)結(jié)果顯示，放氧增強蛋白1在干旱條件下表達量上調(diào)。因此，推測有性四倍體木薯在干旱脅迫中對放氧增強蛋白1及其前體誘導(dǎo)程度更容易，誘導(dǎo)量也更多，更能快速有效地維持光合系統(tǒng)的穩(wěn)定。