馬思遠(yuǎn)，王?；?，林雨彬，曾若菡，刁曉平,3，李 鵬

（1. 海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，?？?571158; 2. 海南大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，?？?570228;3. 海南大學(xué) 南海海洋資源利用國家重點實驗室，?？?570228）

檳榔（Areca catechuL.）屬棕櫚科多年生常綠喬木，是熱帶珍貴藥用植物，為四大南藥之首。海南是我國檳榔的主產(chǎn)區(qū)，全省檳榔種植面積約為102 530 hm2，產(chǎn)量約255 114 t，占全國產(chǎn)量的95%以上，主要分布于萬寧市（18 138 hm2）、瓊海市（16 311 hm2）、瓊中縣（12 447 hm2）、屯昌縣（11 092 hm2）、定安縣（8 917 hm2）和保亭縣（6 685 hm2）[1]。目前，海南約有230萬農(nóng)民從事檳榔種植，檳榔已經(jīng)成為海南農(nóng)民重要的經(jīng)濟(jì)來源。海南檳榔產(chǎn)業(yè)年產(chǎn)值超過百億元，已經(jīng)成為海南省重要的支柱產(chǎn)業(yè)[1]，但在檳榔種植規(guī)模迅速擴(kuò)大的同時，檳榔黃化現(xiàn)象對海南省檳榔產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅。據(jù)初步調(diào)查，海南省已有上萬畝檳榔樹出現(xiàn)了黃化現(xiàn)象，導(dǎo)致植株掛果嚴(yán)重減少，發(fā)病嚴(yán)重的植株會逐漸枯死，且檳榔黃化呈現(xiàn)逐年加重的趨勢，給檳榔產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失[2]。關(guān)于檳榔黃化的病因，有報道認(rèn)為導(dǎo)致檳榔黃化的原因主要包括類細(xì)菌和類菌原體[3]，后來在海南檳榔黃化病病株的葉脈、葉鞘基部發(fā)現(xiàn)植原體[4]，且也有報道認(rèn)為椰心葉甲、介殼蟲、棕櫚長翅蠟蟬、飛虱等害蟲的危害也會導(dǎo)致黃化的發(fā)生；此外，栽培不當(dāng)也會導(dǎo)致檳榔黃化病的發(fā)生，如使用化肥、除草劑和其他用藥不當(dāng)?shù)萚5]。目前，治療檳榔黃化尚無非常有效的防治方法，仍采用挖出病株并燒毀，或使用廣譜性的殺菌劑等方法，但效果均不理想。

生物有機(jī)肥往往通過功能微生物的大量繁殖，改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)而對植物根系形成保護(hù)和促生作用[6]，且根系分泌物介導(dǎo)下的植物－微生物互作關(guān)系變化對于土壤肥力、健康狀況以及植物生長發(fā)育有著極其重要的作用[7]。因此，在植物生長發(fā)育過程中，根系周圍的微生物類群顯著影響著植物對土壤中養(yǎng)分、重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運、作物根際微生物種群的結(jié)構(gòu)等[8]；一些有害微生物也會對作物的生長產(chǎn)生抑制作用，影響其生長發(fā)育[9]。蚯蚓糞是蚯蚓的代謝物，在種植業(yè)上應(yīng)用價值較大。蚯蚓糞本身具有速效、長效、抗病、改良土壤和抗板結(jié)作用[10]，而且其中的功能微生物還可以不斷將土壤中作物難以吸收的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為易吸收的形態(tài)[11]，提高養(yǎng)分利用率，從而提高農(nóng)作物產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)[12]，目前蚯蚓糞已得到了廣泛的應(yīng)用并取得了很好的效果。

由于目前對于檳榔根系微生物組的研究報道較少，且蚯蚓糞緩解檳榔黃化的機(jī)制有待進(jìn)一步解析，本研究擬通過高通量測序技術(shù)比較施用蚯蚓糞前后檳榔跟圍土微生物多樣性的變化，并結(jié)合分析其與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析，探究蚯蚓糞對檳榔園土壤微生物多樣性以及互作網(wǎng)絡(luò)的影響，旨在找出施加蚯蚓糞組、蚯蚓糞和化肥組與對照組的差別，揭示改善檳榔黃化現(xiàn)象的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計研究選取萬寧龍滾檳榔種植園為實驗區(qū)，在根系設(shè)置蚯蚓糞、蚯蚓糞和化肥、無任何添加共3種處理，10個月后進(jìn)行采樣，比較分析施加后3種處理下的土壤細(xì)菌和真菌多樣性變化、微生物多樣性和土壤理化性質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析，并比較了3種處理下的微生物互作網(wǎng)絡(luò)。蚯蚓糞來自三亞鑫苑農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司。全氮、全磷和全鉀含量≥5%，有益活菌≥0.2億個·g-1，有機(jī)質(zhì)含量≥20%，pH7.0。

2019年1月中旬進(jìn)行蚯蚓糞以及化肥的施加，在示范地選取3塊長勢一致的檳榔種植園，檳榔樹齡均為10 a，分別對每棵擯榔樹施加蚯蚓糞（10 kg）、施蚯蚓糞和化肥（10 kg）、不作任何處理的區(qū)域。在兩棵相鄰檳榔樹中間挖10 cm2×50 cm2左右的方形壕溝，分別進(jìn)行上述3種處理。施肥10個月后取樣，在3塊區(qū)域中分別劃分4塊小區(qū)域，每塊小區(qū)域選取3棵檳榔樹，取地下10 cm左右、施肥附近的土壤，每份樣品約500 g。不同處理的區(qū)域各取4份，共12份樣品。在土樣采集時均佩戴無菌手套，將采集的土壤樣品迅速置于冰盒中存放，一部分樣品用于土壤理化性質(zhì)的分析，一部分用于土壤微生物DNA的提取 ，用于提取DNA的土壤樣品帶回實驗室后立即進(jìn)行DNA的提取。

1.2 土壤理化性質(zhì)測定將采集到的土壤自然晾干，按標(biāo)準(zhǔn)法測定樣品的基本理化性質(zhì)[13]。測量指標(biāo)為：pH值、有機(jī)質(zhì)（Organic Matter，OM)、全氮（Nitrogen，N）、堿解氮（Alkali-hydrolyzable nitrogen，HN）、全 磷（Phosphorus，P）、速效磷（Olsen-P，OP）、全鉀（Potassium，K）、速效鉀（Avail K，AK）。

1.3 土壤微生物DNA提取及測序?qū)⒉杉降耐寥肋M(jìn)行DNA的提取，采用德國QIAGEN公司的DNeasy PowerSoil Kit試劑盒，按說明書提取。通過超微量分光光度計（NanoDrop 1000）檢測DNA濃度≥20 ng·mL-1，OD260/280為1.8～2.0。即為合格。提取的DNA保存于-40 ℃條件下用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因的引物采用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，并采用IIIumina Miseq 2·300測序平臺對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙端測序 。測序部分由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 微生物多樣性分析測序完成后，對有效序列進(jìn)行去雜、修剪、去除嵌合體等過濾處理，得到優(yōu)化序列?；贠TU聚類分析結(jié)果，對OTU進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析，以及對測序深度的檢測；基于分類學(xué)信 息，在各個分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對土壤理化性質(zhì)的影響由表1可見，與對照（TLG3）相比，施加蚯蚓糞、蚯蚓糞和化肥處理后土壤理化性質(zhì)表現(xiàn)出明顯差異，所測指標(biāo)都有明顯上升，均具有顯著性差異（P＜0.05）。兩個處理組相比，除施加蚯蚓糞組（TLG1）的pH和速效鉀高于蚯蚓糞加化肥處理組（TLG2）外，其他的理化因子指標(biāo)都 相反，其中全氮、全磷、全鉀、堿解氮和速效鉀達(dá)到顯著性差異。

表1 不同處理方式下檳榔種植區(qū)土壤的理化性質(zhì)Tab. 1 Soil physical and chemical properties in the rhizosphere of arecanut plants in the arecanut plantation

2.2 不同處理方式下檳榔土壤細(xì)菌的多樣性分析

2.2.1 不同處理對細(xì)菌群落多樣性的影響97%相似水平上對土壤樣品細(xì)菌群落進(jìn)行alpha多樣性指數(shù)分析，結(jié)果（表2）表明，與對照組相比，施加蚯蚓糞組和蚯蚓糞加化肥組檳榔土壤細(xì)菌的Shannon指數(shù)有明顯升高，Simple指數(shù)明顯降低，表明施加蚯蚓糞和蚯蚓糞加化肥處理后檳榔土壤細(xì)菌群落多樣性升高，且只施加蚯蚓糞的處理組中的細(xì)菌群落多樣性高于施加蚯蚓糞和化肥的處理組。

表2 細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Tab. 2 Diversity index of bacterial community in the rhizosphere

2.2.2 不同處理對土壤細(xì)菌類群分布的影響在屬水平上對OTU進(jìn)行聚類分析，得到不同處理組的檳榔樹土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果（圖1）表明，在屬水平上只施加蚯蚓糞的處理中，主要的菌屬為熱酸菌屬（Acidothermus，9.45%）、norank_f_norank_o_Acidobacteriales（3.84%）、不動桿菌屬（Acidibacter，3.69%）、Occallatibacter（3.04%）；在施加蚯蚓糞加化肥的處理組中，主要的屬為熱酸菌屬（Acidothermus，13.84%）、norank_f_norank_o_Acidobacteriales（3.52%）、不動桿菌屬（Acidibacter，5.18%）、norank_f_Xanthobacteraceae（4.88%）；在對照組中主要的屬為：norank_f_norank_o_Subgroup_2（10.99%）、norank_f_norank_o_Acidobacteriales（9.48%）、獨活假絲酵母屬（Candidatus Solibacter，5.19%）。此外還包括norank_f_norank_o_Acidobacteriales、norank_f_norank_o_Subgroup_2、norank_f_Xanthobacteraceae、norank_f_norank_o_Elsterales、norank_f_norank_o_norank_c_norank_p_WPS-2、norank_f_norank_o_norank_c_AD3和Conexibacter等。

圖1 屬水平下檳榔土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成Fig. 1 Bacterial community composition at the genus level in the rhizosphere of arecanut plants

2.2.3 不同處理下的細(xì)菌類群顯著性差異分析分別對蚯蚓糞組和蚯蚓糞加化肥組與對照組的細(xì)菌類群在屬的水平上進(jìn)行了組間差異分析。結(jié)果（圖2）表明，在只施加蚯蚓糞與對照的比較中（圖2-a），norank_f_norank_o_Acidobacteriales、獨活假絲酵母屬（Candidatus Solibacter）、norank_f_norank_o_norank_c_AD3和Conexibacter達(dá)到了極顯著水平，norank_f_norank_o_Subgroup_2達(dá)到了顯著性水平。在施加蚯蚓糞-化肥的處理組與對照的比較中（圖2-b），熱酸菌屬（Acidothermus）、獨活假絲酵母屬（Candidatus Solibacter）和Conexibacter達(dá)到了極顯著水平，norank_f_norank_o_Subgroup_2、norank_f_norank_o_Acidobacteriales和norank_f_norank_o_norank_c_AD3達(dá)到了顯著性水平。

圖2 不同處理下細(xì)菌菌屬與對照組差異分析a. 施加蚯蚓糞后；b. 施加蚯蚓糞和化肥后。*表示具有顯著性差異；**和***表示具有極顯著性差異。Fig. 2 Analysis of difference in bacteria at the genus level between the treatments and the controla. Bacterial difference between TLG1 and TLG3 at the genus level; b. Bacterial difference between TLG2 and TLG3 at the genus level. * indicates that there are significant differences between the two treatments；** and *** indicate that there are extremely significant differences in the figure.

2.2.4 不同處理下土壤理化性質(zhì)與微生物分布的相關(guān)性分析結(jié)合理化性質(zhì)，在細(xì)菌門水平上對施加蚯蚓糞前后的土壤和對照組進(jìn)行了Redundancy Analysis（RDA）分析（圖3）。RDA分析顯示，第一主軸能夠解釋所有信息的72.21%，第二主軸能夠解釋11.30%，兩者累計解釋所有信息的83.51%。pH和速效鉀對物種影響程度最大，各環(huán)境因子之間均呈正相關(guān)。只施加蚯蚓糞組中，TLG1-1、TLG1-3、TLG1-4微生物群落變化與所有環(huán)境因子之間呈正相關(guān)，TLG1-2與全鉀、速效磷呈負(fù)相關(guān)，與其余環(huán)境因子呈正相關(guān)。蚯蚓糞加化肥組中，TLG2-1、TLG2-3、TLG2-4與所有環(huán)境因子呈正相關(guān)，TLG2-2與所有環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)。對照組中所有樣本微生物群落變化與所有環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)。變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門（Actinobacteria）與所有環(huán)境因子呈正相關(guān)，WPS-2、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）與所有環(huán)境因子呈負(fù)相關(guān)。其微生物群落程度表現(xiàn)為：酸桿菌門（Acidobacteria）＞綠彎菌門（Chloroflexi）＞W(wǎng)PS-2。

圖3 不同處理下微生物群落與土壤指標(biāo)RDA排序圖Fig. 3 RDA ordination diagram for microbial community and soil index of each treatment

2.2.5 不同處理下物種間的相關(guān)性為了分析物種與物種之間的相關(guān)性，在門的水平上對樣本豐度前50的種進(jìn)行單因素網(wǎng)絡(luò)分析（圖4）。對照組中分類水平總豐度前50的物種中（圖4-c），主要的門為Acidobacteriota（17）、Firmicutes（3）、Planctomycetota（1）、Chloroflexi（9）、WPS-2（1）、GAL15（3）、Myxococcota（1）、Proteobacteria（10）、Actinobacteriota（6）、FCPU426（1）和Bacteroidota（1）；在只施加蚯蚓糞的處理組中（圖4-a），主要的門為Cyanobacteria（1）、Actinobacteriota（14）、Proteobacteria（19）、WPS-2（2）、Patescibacteria（1）、Acidobacteriota（11）和Chloroflexi（2）；在施加蚯蚓糞和化肥的處理組中（圖4-b），主要的門為Proteobacteria（20）、Actinobacteriota（11）、Acidobacteriota（11）、WPS-2（2）、Patescibacteria（1）和Chloroflexi（5）?？梢钥闯銮?0豐度的物種在門水平上處理組相對于對照組少了Firmicutes、Planctomycetota、GAL15、Myxococcota、FCPU426和Bacteroidota所包含的菌種。只施加蚯蚓糞的處理組中多出了Cyanobacteria門的一種菌（s_unclassified_g_norank_f_norank_o_Chloroplast），豐度前50的物種有8種與其有相關(guān)性，其中大多數(shù)為負(fù)相關(guān)。施加蚯蚓糞-化肥的處理組中多出了Patescibacteria門的一種菌（s_uncultured_bacterium_g_norank_f_LWQ8），豐度前50的物種有8種與其有相關(guān)性，其中大多數(shù)為正相關(guān)。

圖4 不同處理下單因素網(wǎng)絡(luò)分析a. 施加蚯蚓糞組；b. 施加蚯蚓糞加化肥組；c. 對照組。圖中節(jié)點的大小表示物種豐度大小，不同顏色表示不同的物種；連線的顏色表示正負(fù)相關(guān)性，紅色表示正相關(guān)，綠色表示負(fù)相關(guān)；線的粗細(xì)表示相關(guān)性系數(shù)的大小，線越粗，表示物種之間的相關(guān)性越高；線越多，表示該物種與其他物種之間的聯(lián)系越密切。Fig. 4 Monofactor network analysis of different treatments a. Monofactor network analysis of TLG1; b. Monofactor network analysis of TLG2; c. Monofactor network analysis of TLG3. The size of nodes in the graph indicates the species richness, and different colors indicate different species; the color of lines indicates positive and negative correlation, red indicates positive correlation, and green indicates negative correlation; the thickness of lines indicates the size of correlation coefficient; the thicker the line, the higher the correlation between the species;the more the lines, the closer the relationship between a species and other species.

3 討 論

施加蚯蚓糞可以提高土壤pH，有效抑制土壤的酸化；且檳榔種植區(qū)的土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效磷和速效鉀的含量均有明顯增加。土壤有機(jī)質(zhì)是土壤養(yǎng)分的重要組成部分[14]，能夠改善土壤的物理和理化性質(zhì)[15]，同時也是各種植物生長的營養(yǎng)來源[16]。施加蚯蚓糞后土壤中有機(jī)質(zhì)含量有明顯升高，表明其土壤得到了改善。

97%相似水平上對土壤樣品細(xì)菌群落進(jìn)行alpha多樣性指數(shù)分析，結(jié)果表明，施加蚯蚓糞后其微生物多樣性升高，這與周東興等[17]的研究結(jié)果一致，周東興等人通過研究施加蚯蚓糞對溫室黑土酶活性以及細(xì)菌多樣性的影響，證明蚯蚓糞的施加提高了土壤的細(xì)菌多樣性。施加蚯蚓糞及蚯蚓糞-尿素的處理均對土壤微生物的多樣性造成了顯著的影響，如獨活假絲酵母屬（Candidatus Solibacter）和Conexibacter出現(xiàn)了顯著性差異，其中獨活假絲酵母屬（Candidatus Solibacter）已有報道表明其為分解有機(jī)質(zhì)、利用碳源的菌屬，與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)關(guān)系[18]。通過土壤理化性質(zhì)和微生物在細(xì)菌門水平上分布的RDA分析，結(jié)果表明，理化因子之間速效鉀的含量達(dá)到顯著性差異，同時N、P、K的含量都有所增高。這與王英男等[19]研究蚯蚓糞可以提高土壤營養(yǎng)物質(zhì)N、P、K含量是一致的。

通過單因素網(wǎng)絡(luò)分析施加蚯蚓糞和施加蚯蚓糞和化肥后的土壤。只施加蚯蚓糞的處理組中多出了Cyanobacteria門的一種菌（s_unclassified_g_norank_f_norank_o_Chloroplast），施加蚯蚓糞-化肥的處理組中多出了Patescibacteria門的一種菌（s_uncultured_bacterium_g_norank_f_LWQ8）。這兩種未命名的菌種對檳榔黃化也許有一定影響。

蚯蚓糞在促進(jìn)作物生長、提高產(chǎn)量、改善土壤肥力和抑制植物病害等方面均有重要作用[20]。錢春桃等[21]將蚯蚓糞肥均勻撒施在松花菜地里，發(fā)現(xiàn)可以有效降低連作地土壤水溶性鹽總量（EC），緩解土壤酸化，提高土壤速效碳氮鉀的含量；張峰等人[22]發(fā)現(xiàn)蚯蚓糞肥極顯著提高土壤NaOH-Po含量和酸性磷酸酶活性，有效促進(jìn)NaOH-Po活化的同時提高微生物對磷的貯存能力，提高磷肥利用率。因此，研究表明蚯蚓糞對改善土壤肥力以及保證作物健康生長具有重要的作用。本研究通過高通量測序技術(shù)對外源施加蚯蚓糞對檳榔種植區(qū)的土壤微生物多樣性進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明，施加蚯蚓糞可顯著提升土壤養(yǎng)分，改善土壤狀況，增強(qiáng)微生物之間的多樣性。此結(jié)果為深入解析蚯蚓糞對檳榔黃化的緩解機(jī)制奠定基礎(chǔ)。