劉林新 ，王修俊 ，張二康 ，于 沛 ，楊麗平 ，陳顏紅

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴陽 550025）

0 引言

泡菜是在發(fā)酵過程中產(chǎn)生獨特風(fēng)味同時又保留了蔬菜本身營養(yǎng)物質(zhì)的特色發(fā)酵食品，目前以自然發(fā)酵為主，存在機(jī)械化低、NIT含量偏高等問題［1］，直投式發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵蔬菜可減少食品安全隱患、保證發(fā)酵品質(zhì)穩(wěn)定，有助于發(fā)酵蔬菜規(guī)范化發(fā)展；而其中固定發(fā)酵劑因其體積小、含水量低，便于貯藏運輸而成為研究熱點。固定化細(xì)胞技術(shù)是由固定化酶技術(shù)發(fā)展而來，最早由千畑一郎提出并應(yīng)用到發(fā)酵產(chǎn)業(yè)［2］，固定化可使菌種長期穩(wěn)定保存，并可反復(fù)利用，減少二次污染，且固定化細(xì)胞具有更好的抗逆性，因其獨特的優(yōu)勢，固定化技術(shù)現(xiàn)已在環(huán)保、化工、食品、制藥等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用［3-6］。陳濤等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過固定化的菌體在冷凍干燥過程中其存活率比菌泥直接凍干要高得多且發(fā)酵更好［7］，其中包埋法因其可以保護(hù)菌體且操作簡單，穩(wěn)定性高，成本低等優(yōu)點，是近年來發(fā)展較為迅速的一種固定化方法［8-9］，而海藻酸鈉［10］、聚乙烯醇［11］、羧甲基纖維素鈉等都是常用的包埋載體［12-14］，因此可將固定化細(xì)胞技術(shù)作為制備直投式發(fā)酵劑的輔助技術(shù)。

本研究采用前期篩選的一株具有高降解NIT含量的發(fā)酵乳桿菌之一LF-8001濃縮菌液，探究其最適宜的固定化條件，以探究成球性、固定化溫度、固定化混合比例、密度、力學(xué)強(qiáng)度等為指標(biāo)，以發(fā)酵乳桿菌菌種存活率、亞硝酸鹽降解率作為判定依據(jù)，試驗得出最佳固定化方式，為菌種包裝貯藏，制備直投式發(fā)酵劑提供有力的技術(shù)條件支撐。

1 試驗材料與設(shè)備

1.1 菌種與試劑

試驗菌種：發(fā)酵乳桿菌LF-8001（Lactobacillus fermentum strain），貴州大學(xué)發(fā)酵工程與生物制藥省級重點實驗室。

試驗試劑：C3H6O3、NaNO3、NaCl、NH3·H2O、NaOH、KOH、Na2CO3、K2HPO4·3H2O，均為分析純，天津科密歐有限公司；海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉、氯化鈣，均為食品級，上海申光食用化學(xué)有限公司；牛肉膏、蛋白胨、酵母膏，生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TMS-Pro物性測定儀（北京盈盛恒泰科技責(zé)任有限公司）；YX280B手提式不銹鋼蒸汽滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械）；VORTEX渦旋混合器（上海達(dá)姆有限公司）；722分光光度計（上海佑科儀表）；GZX-GF101-3-BS-II電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（上海賀德）；GL-20G-II高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 試驗方法及內(nèi)容

1.3.1 試驗方法

1.3.1.1 發(fā)酵乳桿菌菌體分離濃縮

發(fā)酵乳桿菌的分離濃縮采用離心分離，將菌濃度達(dá)到1.08×1010CFU/ml的菌液于5 000 r/min、4 ℃、離心10 min的條件下進(jìn)行分離濃縮。

1.3.1.2 固定化細(xì)胞的制備

將固定化液高溫滅菌，冷卻至室溫后與分離濃縮后的菌液以一定比例混勻，然后逐滴緩慢滴入一定濃度的氯化鈣溶液中，25 ℃恒溫固定2 h，形成3.5±0.2 mm的固定化顆粒，將顆粒取出，用無菌生理鹽水沖洗，后置于無菌生理鹽水中4℃保存?zhèn)溆茫?5］。

1.3.2 發(fā)酵乳桿菌固定化單因素試驗設(shè)計

1.3.2.1 發(fā)酵乳桿菌固定化混合比例的確定

將菌液和固定化液分別以 1：3、1：4、1：5、1：6、1：7的比例混合，以1.3.1.3中方法制備固定化小球，以固定化小球的包埋率、NIT降解能力為指標(biāo)，結(jié)合固定化小球的密度、直徑和力學(xué)強(qiáng)度等物理參數(shù)，探究不同混合比例對固定化的影響。

1.3.2.2 發(fā)酵乳桿菌固定化溫度的確定

將菌液和固定化液按篩選得到的比例混合，然后逐滴緩慢滴入4%氯化鈣溶液中，分別于20、25、30、35、40、45 ℃恒溫固定2 h，形成固定化小球顆粒，將顆粒取出用無菌生理鹽水沖洗，同1.3.2.1中指標(biāo)參數(shù)，探究不同溫度對固定化的影響。

1.3.2.3 發(fā)酵乳桿菌固定化氯化鈣濃度的確定

將菌液和固定化液按篩選得到的比例混合，然后分別逐滴緩慢滴入1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%氯化鈣溶液中以篩選后的溫度恒溫固定，形成固定化小球顆粒，將顆粒取出用無菌生理鹽水沖洗，同1.3.2.1中指標(biāo)參數(shù)，探究不同氯化鈣濃度對固定化的影響。

1.3.3 指標(biāo)測定

（1）機(jī)械強(qiáng)度：即硬度，用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測定，測試條件為：Test Speed = 60 mm/min，Trigger Force= 0.2 N，%Deformation=50.00，Hold Time Between Cycles=0.00。

（2）NIT降解能力：取重量相同的固定化小球投入含亞硝酸鹽100 mg/L的無菌生理鹽水中適溫靜置8 h，按照如下亞硝酸鹽測定方法測定發(fā)酵液中剩余亞硝酸鹽含量，計算亞硝酸鹽降解率，以亞硝酸鹽降解率來反映其NIT降解能力。

（3）亞硝酸鹽測定方法：根據(jù)文獻(xiàn)［16］中方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽的測定采用分光光度計法，參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺比色法測定發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽含量［17］。

亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線測定為y=40.465X-0.272，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線其R2為0.999 53，即所有觀測點中有99.953%的點落在這條直線上，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較高的可信度。

1.3.4 發(fā)酵乳桿菌固定化正交試驗設(shè)計

為了研究各影響因素對發(fā)酵乳桿菌固定化的影響，探究出發(fā)酵乳桿菌最適宜的固定化方式，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取固定化液與菌液的混合比例、固定化溫度、氯化鈣濃度3個因素按L9（34）進(jìn)行正交試驗，以固定化小球的菌濃度、NIT降解能力為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，菌株的因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 混合比例對發(fā)酵乳桿菌固定化的影響

發(fā)酵乳桿菌固定化液與菌液混合比例的不同，不僅會導(dǎo)致混合液中海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉濃度發(fā)生變化，影響最終成球效果和固定化小球的性能，而且會導(dǎo)致發(fā)酵乳桿菌的包埋率發(fā)生改變。按照1.3.2.1的試驗方法，探究不同混合比例對LF-8001發(fā)酵乳桿菌固定化的影響，結(jié)果如表2。

由表2可以看到，發(fā)酵乳桿菌LF-8001的包埋率呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，且在混合比例為1：4時達(dá)到最高的包埋率，其原因可能是在混合比例為1：3時，混合液內(nèi)海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉的濃度較低，導(dǎo)致固定化液粘度較低，形成的固定化小球強(qiáng)度不高，在沖洗的時候菌體有可能隨生理鹽水流出，導(dǎo)致小球內(nèi)包含的菌濃度降低，而隨著混合比例的變化，海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉的濃度逐漸升高，固定化液粘度更大，形成的固定化小球強(qiáng)度也更高，固定在小球內(nèi)的菌體不易流出，包埋率因此上升至穩(wěn)定，但海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉濃度過高時，由于混合液粘度較高使得固定化小球不易成型，或造成拖尾等成球效果不佳的現(xiàn)象［18］。

表2 混合比例對固定化小球參數(shù)影響Tab.2 Effect of mixing ratio on parameters of immobilized pellets

由表2可以看到發(fā)酵乳桿菌LF-8001的亞硝酸鹽降解率均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，且在混合比例為1：4時達(dá)到最高的降解率，原因可能是低濃度的海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉，形成的固定化小球孔隙較大，物質(zhì)交換速率較快，沖洗時菌體有可能隨生理鹽水流出，導(dǎo)致小球內(nèi)包含的菌體濃度降低，致使亞硝酸鹽降解率降低；而過高濃度的海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉，形成的固定化小球其內(nèi)部孔隙較小，菌體被牢牢固定在孔隙中，不易流出，但是由于孔隙較小，物質(zhì)交換速率較低，導(dǎo)致亞硝酸鹽降解率較低，當(dāng)菌液與固定化液的比例為1：4時，恰好使海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉達(dá)到適宜的濃度，此時菌體不會在沖洗時過分流出，也不會導(dǎo)致孔隙較小，因此混合比例為1：4時達(dá)到最高的亞硝酸鹽降解率。綜合考慮成球效果、包埋率和亞硝酸鹽降解率，發(fā)酵乳桿菌LF-8001最佳的混合比例1：4。

2.2 固定化溫度對發(fā)酵乳桿菌固定化的影響

在相同的固定化時間內(nèi)，溫度不同，固定化的效果也不盡相同，溫度通過影響固定化液與氯化鈣的反應(yīng)速率使固定化小球的成球性能發(fā)生變化，并且會對發(fā)酵乳桿菌的包埋率產(chǎn)生一定的影響。按照1.3.2.2的試驗方法，探究不同固定化溫度對發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的影響，結(jié)果如表3。由表3可以看到，發(fā)酵乳桿菌LF-8001的包埋率和NIT降解率總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其原因可能是不同固定化溫度下混合液與氯化鈣的反應(yīng)速度有差別，導(dǎo)致在相同的固定化時間內(nèi)，形成的固定化小球完成度不同，即固定化溫度通過影響固定化小球完成度使包埋率和NIT降解率發(fā)生變化，在適宜的固定化溫度下，混合液與氯化鈣反應(yīng)完全，其包埋率及NIT降解率較高，反之則受影響。

表3 不同溫度下固定化小球參數(shù)Tab.3 Parameter changes of immobilized beads at different temperatures

LF-8001在20～25 ℃進(jìn)行固定時，其包埋率隨溫度升高而增加，形成固定化小球的NIT降解能力也隨固定化溫度的升高而增強(qiáng)，在25 ℃進(jìn)行固定時，其包埋率和形成固定化小球的NIT降解能力達(dá)到最高，而后包埋率和固定化小球的NIT降解能力隨溫度升高逐漸下降。綜合考慮成球效果、包埋率和NIT降解能力，LF-8001最佳的固定化溫度為25 ℃。

2.3 氯化鈣濃度對發(fā)酵乳桿菌固定化的影響

氯化鈣與固定化液反應(yīng)生成海藻酸鈣，過高的濃度會導(dǎo)致固定化小球的通透性降低，從而影響小球內(nèi)外物質(zhì)交換，降低其亞硝酸鹽降解率；而較低的濃度會減弱固定化小球的機(jī)械強(qiáng)度，導(dǎo)致其不宜成形或形狀不規(guī)則。按照1.3.2.3的試驗方法，探究不同氯化鈣濃度對發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的影響，結(jié)果如表4。

表4 不同氯化鈣濃度下固定化小球參數(shù)Tab.4 Parameter changes of immobilized beads under different calcium chloride concentrations

由表4可以看到，LF-8001的包埋率均呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，隨著氯化鈣濃度的升高，LF-8001在氯化鈣濃度達(dá)到5%時其包埋率趨于穩(wěn)定。原因可能是在相同的固定化時間內(nèi)，氯化鈣濃度越高，混合液跟氯化鈣反應(yīng)越快，當(dāng)氯化鈣達(dá)到一定濃度之后，在2 h的固定化時間內(nèi)，形成的固定化小球結(jié)構(gòu)緊密，力學(xué)強(qiáng)度較高，孔隙較小，菌體已經(jīng)基本不會再在沖洗的過程中隨生理鹽水流出，此時盡管氯化鈣濃度繼續(xù)升高，其對包埋率并不會產(chǎn)生顯著影響。

由表4可以看到LF-8001的亞硝酸鹽降解率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。隨著氯化鈣濃度的升高，LF-8001在氯化鈣濃度達(dá)到5%時其亞硝酸鹽降解率達(dá)到最高，而后逐漸下降。原因可能是低濃度的氯化鈣，形成的固定化小球因菌體流出導(dǎo)致包埋率較低，因而亞硝酸鹽降解率較低，隨著氯化鈣濃度的升高，形成的固定化小球強(qiáng)度逐漸增加，孔隙逐漸變小，菌體流出率逐漸降低，在某一濃度其包埋率達(dá)到峰值，且孔隙大小適宜，不影響其物質(zhì)交換速率，此時亞硝酸鹽降解率最高，而后隨著氯化鈣濃度的繼續(xù)升高，形成的固定化小球的其孔隙也越來越小，導(dǎo)致影響其物質(zhì)交換速率，從而影響亞硝酸鹽降解率。綜合考慮成球效果、包埋率和亞硝酸鹽降解率，菌株LF-8001最佳的氯化鈣濃度為5%。

2.4 發(fā)酵乳桿菌固定化正交試驗的優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)1.3.4固定化正交優(yōu)化設(shè)計，對LF-8001的優(yōu)化正交試驗結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表5 正交試驗優(yōu)化結(jié)果Tab.5 The Optimized results orthogonal test

表6 正交實驗方差分析Tab.6 Variance analysis orthogonal test

從表5的正交試驗結(jié)果可以看出，以菌濃度為評價指標(biāo)，根據(jù)極差R1可以得出上述3個因素影響發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的主次關(guān)系為A＞B＞C，即對發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化影響最大的是混合比例，其次是固定化溫度，影響最小的是氯化鈣濃度，由表6的方差分析可知，混合比例對發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的影響有顯著差異，而固定化溫度、氯化鈣濃度對發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的影響不顯著，因此較優(yōu)固定化方法組合為A1B1C1，為正交表中1號試驗；以亞硝酸鹽降解率為評價指標(biāo)，根據(jù)極差R2可以得出上述3個因素影響發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的主次關(guān)系為C＞A＞B，即對發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化影響最大的是氯化鈣濃度，其次是混合比例，影響最小的是固定化溫度，由表6的方差分析可知，氯化鈣濃度對發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的影響有顯著差異，而固定化溫度、混合比例對發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的影響不顯著，因此較優(yōu)固定化方法組合為A1B2C1，此試驗組合未在正交表中出現(xiàn)，對該組合進(jìn)行三次平行實驗，得到該條件下菌濃度為1.49×1011CFU/g，亞硝酸鹽降解率為91.23%，稍優(yōu)于1號試驗的結(jié)果，因此綜合考慮菌株濃度和亞硝酸鹽降解率這兩個指標(biāo)，發(fā)酵乳桿菌LF-8001最佳固定化方法組合為A1B2C1，即混合比例1：4，固定化溫度25 ℃，氯化鈣濃度4%。

3 結(jié)語

研究確定了LF-8001最佳固定化方法，以含1.2%海藻酸鈉 0.5%羧甲基纖維素鈉的溶液為固定化液，菌液和固定化液以1：4的比例混合均勻，然后逐滴緩慢滴入4%的氯化鈣溶液中，恒溫25 ℃固定2 h，在此條件下包埋率較高，固定化小球的活菌數(shù)達(dá)1.49×1011CFU/g，亞硝酸鹽降解率達(dá)到91.23%，該固定化技術(shù)可獲得具有菌種存活率高、便于運輸貯藏，方便使用于工業(yè)化生產(chǎn)當(dāng)中的固定化小球。