吳潔瑩，吳韶清，陳勁松，陸 琰，湯雪薇，李 焱

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心<廣州臍血庫> 廣東 廣州 510623）

與骨髓和外周血干細(xì)胞的供者資料庫不同，臍血庫是將臍帶血以實(shí)物形式置于液氮中長(zhǎng)期凍存，一旦與受者匹配，可在短時(shí)間內(nèi)快速解凍并回輸。雖然極大提高了治療的可及性，但是，長(zhǎng)期凍存和復(fù)蘇都會(huì)不可避免地影響臍帶血的造血功能[1-3]。由于臍帶血只能采集一次，數(shù)量有限，可供檢測(cè)的樣本更少。如何快速、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)復(fù)蘇后臍帶血的造血功能，是臍血庫質(zhì)量控制、產(chǎn)品放行，及移植中心供體選擇、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等過程中都必須關(guān)注的重點(diǎn)[4-5]。本文探討非離心的免疫磁珠法在檢測(cè)冷凍復(fù)蘇后臍帶血造血功能中的應(yīng)用。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選擇廣州臍血庫2014 年11 月—2018 年1 月的76份樣本（常規(guī)法組）和2018 年2 月—2020 年12 月的73份樣本（新方法組）。冷凍前從臍血采集袋取樣，復(fù)蘇后從附屬血辮取樣。此階段實(shí)驗(yàn)室的操作環(huán)境和儀器設(shè)備運(yùn)行穩(wěn)定，技術(shù)人員相對(duì)固定，數(shù)據(jù)具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器IMDM 培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco 公 司， 批 號(hào)：1843036/2150863； 胎 牛 血清 購 自 美 國(guó)Gibco 公 司，批 號(hào)：1908360C；DNA 酶（RNase-Free DNase）購自美國(guó)Promega 公司，批號(hào)：0000231528/0000335463；ErythroClearTMRed Blood Cell Depletion 試劑盒購自加拿大Stemcell 公司，批號(hào)：19C101192/1000012783；臺(tái)盼藍(lán)染液購自Sigma 公司，批號(hào)：TRB0850；甲基纖維素半固體培養(yǎng)基購自加拿大Stemcell 公司，批號(hào)：18M98047/1000019901；流式抗體：CD45-異硫氰酸熒光素（FITC）、CD34-藻紅蛋白（PE）、免疫球蛋白（IgG）-PE、7-氨基放線菌素（AAD）及溶血素購自美國(guó)BD 公司，批號(hào)：8311690/8341967/9015 728/9134970/9029989；生物潔凈工作臺(tái)購自蘇州蘇靜安泰空氣技術(shù)有限公司，型號(hào)：BCM-1600A；低溫高速離心機(jī)購自美國(guó)IEC 公司，型號(hào)：GP8 R；流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BD 公司，型號(hào)：BD FACS Canto Ⅱ；血細(xì)胞分析儀購自美國(guó)貝克曼庫爾特公司，型號(hào)：Ac.T diff2，恒溫水浴箱購自美國(guó)Coring 公司，型號(hào)LSE waterbath 6 L；旋渦震蕩儀購自美國(guó)IKA 公司，型號(hào)：LAB Dancer S25；醫(yī)用冷藏箱購自海信（北京）電器有限公司，型號(hào)：BCD-196TA；CO2培養(yǎng)箱購自德國(guó)Labotect 公司，型號(hào)：C200；倒置顯微鏡購自日本Olympus 及Nikon 公司，型號(hào)：CHK 及TE300。

1.2.2 常規(guī)法（洗滌離心）將臍血從液氮中移至氣相，放置5 min。打開鋁夾，取出附屬血辮，浸入37℃恒溫水浴箱，快速完成復(fù)溫。取100 uL樣本用于有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、活率檢測(cè)，其余約400 ～500 uL 轉(zhuǎn)移至15 mL 無菌離心管，緩慢加入預(yù)冷的含2%胎牛血清（FBS）和10 U/mL DNase 的IMDM 培養(yǎng)基，輕輕搖動(dòng)離心管。置10℃條件下，1 500 rpm、離心10 min。小心取出上清液，重懸細(xì)胞沉淀。重復(fù)洗滌離心一次。棄去上清，加入IMDM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，用于CD34 陽性細(xì)胞檢測(cè)和干/祖細(xì)胞集落培養(yǎng)。

1.2.3 新方法（磁珠法）同前復(fù)溫后，取50 uL 樣本用于有核細(xì)胞計(jì)數(shù)。另取50 ～100 uL 樣本置于2 mL無菌離心管，加入280 uL 含2%FBS 的磷酸鹽緩沖液（DPBS）及170 uL ErythroClearTM試劑，用吸頭徹底混勻，室溫（15 ～25℃）孵育1 min 后，開蓋置于磁極中，靜置1 min。期間觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞分層現(xiàn)象（即上層為透明清亮液體，底部為斜面狀紅細(xì)胞沉淀）。待分層穩(wěn)定后，用1 000 uL 吸頭沿離心管壁，小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移至另一新無菌離心管（切勿觸碰底層紅細(xì)胞沉淀），用于活率、CD34 陽性細(xì)胞檢測(cè)和干/祖細(xì)胞集落培養(yǎng)。詳見ErythroClearTMRed Blood Cell Depletion 試劑盒操作說明。

1.2.4 樣本檢測(cè) 有核細(xì)胞計(jì)數(shù)：采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)。讀取屏幕上顯示的白細(xì)胞（WBC）數(shù)值，細(xì)胞總數(shù)=WBC×臍血體積。

細(xì)胞活率檢測(cè)：采用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量，計(jì)數(shù)100 個(gè)有核細(xì)胞，被染色的為死細(xì)胞，未染色的為活細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞比例。

CD34 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：標(biāo)記流式管，設(shè)同型對(duì)照，將制備好的細(xì)胞懸液各50 uL 分別加入對(duì)照管及實(shí)驗(yàn)管，對(duì)照管加入10 uL CD45-FITC 及10 uL IgG-PE 熒光抗體，實(shí)驗(yàn)管加入10 uL CD45-FITC 及10 uL CD34-PE 熒光抗體，避光孵育20 min。各管分別加入5 uL 7-AAD，繼續(xù)孵育5 min。加入2 mL PBS，于1 500 rpm 離心5 min，棄上清，再以300 uL PBS 重懸細(xì)胞沉淀，上機(jī)檢測(cè)。采用洗滌離心制備的細(xì)胞懸液，標(biāo)記后還要溶血。分析結(jié)果得到CD34 陽性細(xì)胞占CD45 陽性有核細(xì)胞的百分比，再根據(jù)復(fù)溫后臍血的細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算出每份臍血中的CD34 陽性細(xì)胞的數(shù)量。

造血祖細(xì)胞集落分析：采用MethodCult（GF H4434半固體甲基纖維素培養(yǎng)基，以105細(xì)胞/mL 的密度接種于12 孔板中，每孔終體積1 mL，每樣本設(shè)雙復(fù)孔。置37℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)14 ～16 d。倒置顯微鏡下觀察粒-巨噬細(xì)胞集落形成單位（CFU-GMs）、爆式紅細(xì)胞集落形成單位（BFU-E）和粒細(xì)胞-紅細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-巨核細(xì)胞集落形成單位（CFU-GEMM），求和得到祖細(xì)胞集落形成單位總數(shù)（CFUs），再根據(jù)復(fù)蘇臍血的細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算出每份臍血中的集落數(shù)量。

1.3 觀察指標(biāo)

選擇兩組樣本冷凍前后的總有核細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活率、CD34 陽性細(xì)胞數(shù)、CFU-GMs 及CFUs 和上述各項(xiàng)參數(shù)的變化（回收率）為觀察指標(biāo)，計(jì)算公式如下。

總有核細(xì)胞回收率（%）=（復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)/冷凍前細(xì)胞數(shù)）×100%。

細(xì)胞活率（%）=[活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）]×100%。

細(xì)胞活率回收率（%）=（復(fù)蘇后細(xì)胞活率/冷凍前細(xì)胞活率）×100%。

CD34 陽性細(xì)胞回收率（%）=（復(fù)蘇后CD34 陽性細(xì)胞數(shù)/冷凍前CD34 陽性細(xì)胞數(shù)）×100%。

CFU-GMs 回收率（%）=（復(fù)蘇后CFU-GMs 數(shù)量/冷凍前CFU-GMs 數(shù)量）×100%。

CFUs 回收率（%）=（復(fù)蘇后CFUs 數(shù)量/冷凍前CFUs 數(shù)量）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)；連續(xù)變量之間的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)性分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 兩組臍血的冷凍前和復(fù)蘇后的各項(xiàng)參數(shù)及回收率比較

兩組樣本復(fù)蘇后的總有核細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活率、CD34陽性細(xì)胞數(shù)、CFU-GMs 及CFUs 數(shù)量較冷凍前均有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。新方法組的細(xì)胞活率的回收率低于常規(guī)法組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），而兩組的有核細(xì)胞回收率、CD34 陽性細(xì)胞回收率、CFUGMs 回收率和CFUs 回收率等的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組臍血的冷凍前和復(fù)蘇后的各項(xiàng)參數(shù)及回收率比較

2.2 兩組臍血的復(fù)蘇后CD34 陽性細(xì)胞數(shù)和CFUs 的相關(guān)性分析

兩組樣本的CD34 陽性細(xì)胞數(shù)和CFUs 數(shù)量均有相關(guān)性（新方法組：r=0.744，P＜0.001；常規(guī)法組：r=0.631，P＜0.001），見圖1。

圖1 兩組臍血的復(fù)蘇后CD34 陽性細(xì)胞數(shù)和CFUs 的相關(guān)性曲線

3.討論

臍帶血的制備是采用儀器或手工分離法，去除大部分的血漿和紅細(xì)胞，收集富含造血干細(xì)胞等多種干細(xì)胞及免疫細(xì)胞的白膜層，保存于液氮中的完整過程。為保證回收率，終產(chǎn)品可能含有一定比例的紅細(xì)胞，而這些紅細(xì)胞會(huì)影響造血干/祖細(xì)胞（HSPCs）的造血功能評(píng)價(jià)，如：CD34 陽性細(xì)胞流式檢測(cè)、集落形成單位數(shù)量分析，乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測(cè)等的準(zhǔn)確性[6-7]。常規(guī)去除紅細(xì)胞的方法包括洗滌沉降法或氯化銨裂解法，均需要較長(zhǎng)作用時(shí)間或離心，對(duì)冷凍復(fù)蘇后樣本，易造成細(xì)胞損傷、凝塊，導(dǎo)致細(xì)胞丟失。與冷凍袋相比，附屬血辮中的微量樣本在降溫程序中處于更低的溫度，對(duì)冰晶損傷可能更敏感，因此常規(guī)方法尤其不適于冷凍袋的附屬血辮中微量樣本的檢測(cè)[8-10]。本庫自2018 年2 月起，采用加拿大Stemcell 公司的ErythroClearTM試劑盒，取代洗滌離心溶血的常規(guī)方法，對(duì)臍帶血附屬血辮中的微量樣本進(jìn)行檢測(cè)。雖然兩種方法制備的臍血樣本的總有核細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活率、CD34 陽性細(xì)胞數(shù)、CFU-GMs 及CFUs較冷凍前均有所降低（P＜0.05），但是，兩組樣本的冷凍前后CD34 陽性細(xì)胞回收率，粒-巨噬細(xì)胞集落回收率、祖細(xì)胞集落回收率均無顯著差異（P＞0.05）；同時(shí)，兩組樣本復(fù)蘇后的CD34 陽性細(xì)胞數(shù)和CFUs 均存在高度相關(guān)性，表明CD34 陽性細(xì)胞數(shù)的測(cè)定結(jié)果均能準(zhǔn)確反映出具有該標(biāo)記的造血干/祖細(xì)胞的生物學(xué)特性，新方法不會(huì)改變樣本的造血干/祖細(xì)胞分布頻率和增殖能力。但本研究的數(shù)據(jù)也顯示，新方法組的細(xì)胞活率的回收率低于常規(guī)法組，表明新方法對(duì)細(xì)胞活率的檢測(cè)有一定影響。

新方法的優(yōu)勢(shì)主要有兩個(gè)方面：首先是減少操作時(shí)間，提高制備效率：常規(guī)法將復(fù)蘇后的臍帶血加入預(yù)冷的培養(yǎng)基稀釋后，小心混勻離心洗滌兩次，棄去上清，加入緩沖液，反復(fù)輕柔吹打調(diào)整至適宜濃度的細(xì)胞懸液，操作時(shí)間大于20 min；而磁珠法將樣本加入緩沖液和磁珠分離試劑，混勻后靜置1 min，再放入磁極作用約1 min 或至細(xì)胞懸液清晰，即可吸出上清液。由于磁極有16 個(gè)樣本位，可在約2 min 內(nèi)同時(shí)完成16 個(gè)待檢樣本的紅細(xì)胞分離，極大地提高了制備效率。其次是節(jié)約樣本量，改善制備質(zhì)量：磁珠法僅需要約50 ～100 uL 的血樣制備細(xì)胞懸液，并可立即用于流式分析和干/祖集落培養(yǎng)，若置于4℃靜置存放，也很少出現(xiàn)細(xì)胞凝集成團(tuán)的現(xiàn)象；而常規(guī)法需要400 ～500 uL 血樣，經(jīng)過反復(fù)離心、洗滌、吹打，即使在體系中加入DNase，也容易產(chǎn)生肉眼可見的細(xì)胞凝塊。為保證流式檢測(cè)中管路通暢，順利收集到細(xì)胞信號(hào)，通常需要用400 目濾膜去除凝塊。同時(shí)，由于損失了相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞，給流式結(jié)果的分析造成一定困難。

當(dāng)然，新方法也存在局限性。首先，磁珠吸附后獲得的細(xì)胞懸液終體積約500 uL（上樣體積為550 uL，扣除吸附在磁極中的紅細(xì)胞及磁珠沉淀），有時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞終濃度偏低；若減少上樣體積，又會(huì)影響分離體系和磁極作用面積，降低分離效率。如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)樣本濃度和樣本體積有要求（如細(xì)胞分選），則須增加離心濃縮步驟。另外，磁極作用后的細(xì)胞活率會(huì)降低，但在處理新鮮血液樣本時(shí)，此現(xiàn)象并不明顯（數(shù)據(jù)未顯示），推測(cè)可能原因有：（1）與磁場(chǎng)有關(guān)，冷凍復(fù)蘇后的細(xì)胞對(duì)磁場(chǎng)作用更敏感；（2）與試劑有關(guān)，磁珠或緩沖液可能與檢測(cè)細(xì)胞活率的試劑發(fā)生干擾，造成假陽性，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，免疫磁珠法可用于快速檢測(cè)冷凍復(fù)蘇后的臍帶血造血功能，特別適用于冷凍袋附屬血辮的微量樣本。以本庫采用的50 mL CryoMACS?冷凍袋為例，含有臍帶血終產(chǎn)品的冷凍袋在密封前應(yīng)保留的一段附屬連接管（血辮），其容量約為600 uL。每次需100 uL 血量，使總量約600 uL 的附屬血辮可分為數(shù)小段，進(jìn)行多項(xiàng)目多次檢測(cè)，可以滿足現(xiàn)行的全球先進(jìn)輸血和細(xì)胞治療聯(lián)盟（AABB）《細(xì)胞治療服務(wù)標(biāo)準(zhǔn)（第9 版）》（9th edition）中“臍血產(chǎn)品至少需要兩個(gè)完整的附屬血辮與產(chǎn)品一起冷凍保存”及“用于造血重建的產(chǎn)品在附屬連接段取樣檢測(cè)集落形成單位和（或）CD34 陽性細(xì)胞（直接測(cè)量）”的規(guī)定[11]。