陳善義 陳義強(qiáng)

摘 要：為明確不同醇化方式的片煙細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，以3個(gè)等級(jí)的片煙為材料，采用氣調(diào)醇化和自然醇化2種方式進(jìn)行倉(cāng)儲(chǔ)養(yǎng)護(hù)，以初始樣為對(duì)照，利用MiSeq高通量測(cè)序?qū)?種醇化方式的片煙細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，醇化3年后，2種醇化方式片煙中細(xì)菌的多樣性水平降低，且氣調(diào)醇化法低于自然醇化法;據(jù)非度量多維尺度分析，2種醇化方式的樣品能明顯地區(qū)分開來(lái);甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬占比在醇化過(guò)程中呈下降之勢(shì)，在2種醇化方式之間的差異不顯著;鹽單胞菌屬占比呈上升之勢(shì)，且氣調(diào)醇化顯著高于自然醇化。

關(guān)鍵詞：微生物區(qū)系;煙草;倉(cāng)儲(chǔ)養(yǎng)護(hù);氣調(diào)醇化;自然醇化

中圖分類號(hào) TS441文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）11-0051-02

片煙的醇化是指在一定條件下，通過(guò)煙葉自身的微生物作用、酶的催化和氧化作用，使煙葉中一些不利于吸食品質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為對(duì)感官質(zhì)量有利的物質(zhì)，達(dá)到提高煙葉使用價(jià)值的過(guò)程。片煙的倉(cāng)儲(chǔ)醇化主要有2種方法：自然醇化法和氣調(diào)醇化法。自然醇化法操作簡(jiǎn)便，成本低。但在實(shí)踐中存在片煙易于發(fā)生霉變和蟲蛀等現(xiàn)象，以及醇化周期不易調(diào)控、質(zhì)量最佳狀態(tài)保持時(shí)間較短等不足之處。氣調(diào)醇化法是在密封環(huán)境下，通過(guò)人工調(diào)控氧氣的含量，達(dá)到防霉、殺蟲、延長(zhǎng)片煙儲(chǔ)存品質(zhì)時(shí)間的目的。對(duì)2種醇化方式差異的研究，目前主要集中在外觀質(zhì)量、感官質(zhì)量和常規(guī)化學(xué)成分、pH方面[1-4]。陳善義等[5]研究了氣調(diào)醇化過(guò)程中片煙細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，但關(guān)于2種醇化方法片煙細(xì)菌區(qū)系差異的研究尚不多見(jiàn)。為此，本研究利用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析氣調(diào)醇化和自然醇化的片煙細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，旨在為片煙氣調(diào)養(yǎng)護(hù)的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)片煙樣品產(chǎn)地為貴州（代號(hào)GZ）、福建（代號(hào)FJ）、河南（代號(hào)HN）。片煙于廈門東孚煙葉倉(cāng)庫(kù)（倉(cāng)庫(kù)環(huán)境年平均氣溫和相對(duì)濕度分別為25℃和58%）采用氣調(diào)醇化和自然醇化2種方式進(jìn)行倉(cāng)儲(chǔ)養(yǎng)護(hù)。片煙入庫(kù)后立即取樣作為初始樣（代號(hào)為O）。氣調(diào)醇化的操作按《片煙貯存養(yǎng)護(hù)氣調(diào)貯存法》YC/T 322—2018[6]相關(guān)要求進(jìn)行。自然醇化則將片煙按200Kg/箱的規(guī)格進(jìn)行裝箱打包后，于片煙倉(cāng)庫(kù)中自然條件下醇化。醇化3年后分別取樣（氣調(diào)醇化代號(hào)為A，自然醇化代號(hào)為N）。

1.2 試驗(yàn)方法 樣品基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增、MiSeq測(cè)序、數(shù)據(jù)處理與分析參考包可翔等[7]及陳善義等[5]的研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌物種的多樣性 由表1可知，氣調(diào)醇化3年的樣品Chao值小于初始樣及自然醇化3年的樣品，表明氣調(diào)醇化3年后的樣品細(xì)菌物種豐富度最小;樣品Shannon指數(shù)均值大小排列為初始樣>自然醇化（3年）>氣調(diào)醇化（3年），且三者之間的差異極顯著，這說(shuō)明醇化3年后的片煙細(xì)菌物種多樣性低于初始水平，且氣調(diào)醇化法醇化的片煙細(xì)菌多樣性水平最低。

2.2 屬水平細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)差異 由圖1可知，初始樣、氣調(diào)及自然醇化法醇化后3年的片煙表面的細(xì)菌菌群，主要由甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、Aureimonas、假單胞菌屬、大腸志賀氏桿菌、葡萄球菌屬、鹽單胞菌屬組成。甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬占比在醇化3年后的樣品中顯著低于初始樣，而在自然醇化和氣調(diào)醇化樣品之間的差異不顯著;鹽單胞菌屬占比在初始樣、自然醇化及氣調(diào)醇化后3年的樣品中差異極顯著，其占比排列為氣調(diào)醇化（3年）>自然醇化（3年）>初始樣（表2）。這說(shuō)明在屬分類水平上，相較于初始樣而言，醇化3年后片煙的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大的變化，表現(xiàn)為：甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬占比顯著下降;而鹽單胞菌屬占比顯著提高，且氣調(diào)醇化其菌群占比顯著高于自然醇化。

2.3 NMDS分析 非度量多維尺度（Nonmetric Multidimensional Scaling，NMDS）分析通過(guò)描述樣品間的距離遠(yuǎn)近關(guān)系，進(jìn)一步說(shuō)明了樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異性。由圖2可知，同一種處理的樣品在NMDS二維圖上距離較近（除初始樣的HN-O樣品之外），不同處理的樣品距離較遠(yuǎn)，這說(shuō)明片煙細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在不同處理間差異大于同一處理內(nèi)樣品之間的差異;此外，自然醇化3年后和氣調(diào)醇化3年后的樣品與初始樣的樣品距離較大，說(shuō)明醇化3年后，片煙細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)相較于初始樣變化較大。

3 討論

利用MiSeq高通量測(cè)序分析了氣調(diào)醇化及自然醇化3年后的片煙與初始樣中細(xì)菌的物種多樣性和群落結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)醇化3年后的片煙細(xì)菌物種豐富性和多樣性水平降低，這與伍雪瑩等[8]、楊金奎等[9]對(duì)陳化烤煙微生物的變化研究結(jié)果一致。周家喜等[10]對(duì)煙葉陳化過(guò)程細(xì)菌群落演替特征的研究中發(fā)現(xiàn)，甲基桿菌屬的豐度隨醇化過(guò)程的進(jìn)行呈下降之勢(shì)，鞘氨醇單胞菌屬則呈上升之勢(shì)，而本研究發(fā)現(xiàn)上述2個(gè)菌屬占比均低于初始水平。造成這一差異的可能的原因是周家喜等[10]的研究主要關(guān)注醇化24個(gè)月以內(nèi)的時(shí)期，而本研究關(guān)注醇化36個(gè)月后的細(xì)菌區(qū)系。本研究發(fā)現(xiàn)，醇化3年后，2種醇化方式片煙細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異主要表現(xiàn)在鹽單胞菌屬的占比上。鹽單胞菌屬屬于鹽單胞菌科，是一類能在絕對(duì)鹽度（NaCl）為0～32%條件下生長(zhǎng)的耐鹽細(xì)菌[11]。醇化較久的煙葉，是否在微生物的代謝過(guò)程中生成一些鹽類物質(zhì)尚不清楚。鹽單胞菌屬在煙葉醇化過(guò)程中的作用，以及不同醇化方式的片煙有關(guān)鹽類物質(zhì)含量的差異有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

片煙在醇化過(guò)程中，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化，甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬占比下降，鹽單胞菌屬占比上升;自然醇化和氣調(diào)醇化片煙細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)差異主要表現(xiàn)在鹽單胞菌屬占比上，且氣調(diào)醇化高于自然醇化。

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（責(zé)編：王慧晴）