馬驍，劉萬(wàn)紅

0 引言

人腺病毒（human adenovirus,HAdV）最初由挪威Rowe等于1953年在健康成年人中的扁桃腺樣組織中進(jìn)行分離培養(yǎng)出來(lái)，1954年希勒曼對(duì)患有急性呼吸道感染的患者進(jìn)行研究，從咽喉分泌物中分離到相同的病毒，1956年，國(guó)際病毒委員會(huì)（ICTV）將這種病毒命名為人腺病毒[1]。

人腺病毒基因組長(zhǎng)約36 kb[2]，含九類(lèi)基因，按照復(fù)制時(shí)間分為早期轉(zhuǎn)錄基因和晚期轉(zhuǎn)錄基因[3-4]，其中關(guān)于早期表達(dá)與腺病毒有關(guān)的基因?yàn)镋1～E3、E7基因，晚期表達(dá)與腺病毒有關(guān)的基因有5種，為L(zhǎng)1～L5基因[4]。

癌癥是造成人類(lèi)死亡的重要原因之一，對(duì)大多數(shù)腫瘤類(lèi)型來(lái)說(shuō)，目前的醫(yī)療技術(shù)仍無(wú)法治愈。溶瘤病毒療法一直被認(rèn)為是一種有前途的抗癌基因治療策略[5]。人腺病毒是研究廣泛的溶瘤病毒之一，能特異性感染并裂解腫瘤細(xì)胞，溶瘤腺病毒療法在治療癌癥方面已經(jīng)取得了一定進(jìn)展[6]。HAdV-C5型人腺病毒是使用最廣泛的溶瘤腺病毒之一，目前有臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HAdV-C5型人腺病毒的中和性免疫阻礙了對(duì)人前列腺癌的治療效果[7]，B型溶瘤腺病毒能夠明顯地裂解骨肉瘤細(xì)胞[8]。因此，針對(duì)不同癌癥選用合適類(lèi)型的人腺病毒用于溶瘤腺病毒療法非常重要。

根據(jù)人腺病毒基因組的DNA序列特點(diǎn)、六鄰體蛋白特點(diǎn)、纖突特點(diǎn)以及免疫原性可將人腺病毒分為HAdV-A-G共7個(gè)亞屬[3]，102個(gè)基因型[9]。截至目前，仍有少部分HAdV基因組未能明確分型。為此，本研究從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集到11株2012—2019年來(lái)自中國(guó)未明確分型的HAdV完整基因組序列，并收集國(guó)內(nèi)外已明確分型的HAdV基因組序列，通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)這些未能明確分型的HAdV進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)、基因同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析，從基因?qū)用嫔蠈?duì)這些未知HAdV序列進(jìn)行分型。

1 材料與方法

1.1 病毒株來(lái)源與基本信息

本研究所需的基因序列全部來(lái)自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。其中11株尚未明確分型的完整HAdV基因組序列均來(lái)自中國(guó)，另外67株已明確基因型的HAdV病毒株，分別來(lái)自HAdV-A到HAdV-G不同亞屬共67個(gè)基因型，以及7株國(guó)際上公認(rèn)的HAdV參照基因組序列，將這74株基因組序列作為系統(tǒng)進(jìn)化分析的參照序列。本研究11株未知亞屬病毒株序列的基本信息，包括病毒株收集時(shí)間和地區(qū)、基因登錄號(hào)（Accession Numbers）、病毒株的名稱(chēng)，見(jiàn)表1。

表1 未明確分型的11株HAdV病毒株信息Table 1 Information of 11 unverified HAdV strains

1.2 生物信息學(xué)方法

1.2.1 系統(tǒng)進(jìn)化分析 使用DNA Star軟件中的EditSeq工具將收集到的所有HAdV基因組序列以FASTA格式保存以便于后續(xù)分析[10]。將11株未明確分型的HAdV基因組序列、67株已明確基因型的參照HAdV基因組序列以及7株國(guó)際公認(rèn)的HAdV參照序列利用MEGA7.0軟件中的鄰接法構(gòu)建HAdV病毒株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析未明確分型的HAdV序列與已知HAdV序列之間的進(jìn)化關(guān)系，選擇Kimura 2-parameter模型，自展次數(shù)選擇1 000次[11]。

1.2.2 基因同源性分析 利用DNA Star軟件中的MegAlign工具將未明確分型HAdV序列與已知序列進(jìn)行比對(duì)，分析基因序列之間的同源性，算法選擇Clustal W[10]。

2 結(jié)果

2.1 HAdV基因組的系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示：同亞屬的HAdV之間進(jìn)化關(guān)系十分明顯，可以用來(lái)推測(cè)未明確分型病毒株的進(jìn)化關(guān)系，見(jiàn)圖1。

圖1 基于HAdV基因組數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 1 Phylogenetic tree of whole HAdV genome

MH634393和KF302429兩株HAdV病毒株與D型HAdV病毒株序列進(jìn)化關(guān)系較近；KY002683和KY002684兩株HAdV病毒株與B型HAdV病毒株序列進(jìn)化關(guān)系較近；MK570618的HAdV病毒株與C型HAdV病毒株序列進(jìn)化關(guān)系較近；MK570619的HAdV病毒株與F型HAdV病毒株序列進(jìn)化關(guān)系較近。剩下5株HAdV病毒株（MH256653、MH256654、MH256655、MH256656、MH256657）相互之間的進(jìn)化關(guān)系比較接近，但是與其他參照病毒株進(jìn)化關(guān)系不是非常明顯，對(duì)這5株HAdV病毒株的分型還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2 基因組序列同源性分析

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，預(yù)測(cè)出6株未明確分型HAdV基因組序列的可能分型，將這6株HAdV序列分別與預(yù)測(cè)分型的參照序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，觀察基因組序列之間的同源性。

2.2.1 將MH634393和KF302429基因組序列與HAdV-D參照基因組序列以及進(jìn)化關(guān)系最近的基因組序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MH634393與D型HAdV參照基因組序列同源性為92.7%，KF302429與D型HAdV參照基因組序列同源性為98.1%，見(jiàn)表2，與之前系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果相符合，可以推斷出這兩株未明確類(lèi)型的HAdV病毒株為D型HAdV。

表2 MH634393、KF302429與D型HAdV基因組多序列比對(duì)結(jié)果Table 2 Multiple sequence alignment results among MH634393,KF302429 and HAdV-D genome

2.2.2 將MK570618基因組序列與HAdV-C參照基因組序列以及進(jìn)化關(guān)系最近的基因組序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MK570618與3株C型HAdV序列的同源性都比較低，基因組序列上存在較大差異，見(jiàn)表3，與系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果不符，推測(cè)MK570618不是C型HAdV。

表3 MK570618與C型HAdV基因組序列多序列比對(duì)結(jié)果Table 3 Multiple sequence alignment results among MK570618 and HAdV-C genome

2.2.3 將KY002683和KY002684基因組序列與HAdV-B參照基因組序列以及進(jìn)化關(guān)系最近的基因組序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：KY002683和KY002684之間的同源性是100%，與B1型HAdV基因組序列（NC_011203）的同源性為84.8%，與B2型HAdV基因組序列（NC_011202）的同源性為97.8%，見(jiàn)表4，故推測(cè)這兩株HAdV應(yīng)該屬于B2型HAdV，此結(jié)果也與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果相符合。

表4 MH634393、KF302429與B型HAdV基因組多序列比對(duì)結(jié)果Table 4 Multiple sequence alignment results among MH634393,KF302429 and HAdV-B genome

2.2.4 將MK570619基因組序列與HAdV-F參照基因組序列以及進(jìn)化關(guān)系最近的基因組序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MK570619和3株HAdV-F的基因組序列之間的同源性較低，只有64.1%～64.4%，見(jiàn)表5。說(shuō)明MK570619與F型HAdV的基因組序列存在較大差異，推測(cè)可能是由于在做系統(tǒng)進(jìn)化分析時(shí)結(jié)果存在一定誤差，排除是F型HAdV的可能性。這株HAdV無(wú)法從基因?qū)用嫔蠈?duì)其分型，可能需要通過(guò)對(duì)其蛋白質(zhì)的分析來(lái)推斷出MK570619的分型。

表5 MK570619與F型HAdV基因組多序列比對(duì)結(jié)果Table 5 Multiple sequence alignment results among MK570619 and HAdV-F genome

2.2.5 通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析預(yù)測(cè)出了6株未明確分型的HAdV所屬亞屬，但仍有5株進(jìn)化關(guān)系不明顯，無(wú)法從系統(tǒng)進(jìn)化分析中推測(cè)出具體分型。將這5株HAdV與7株HAdV參照序列（HAdV-A、HAdV-B1、HAdV-B2、HAdV-C、HAdV-D、HAdV-E、HAdV-F）進(jìn)行多序列比對(duì)，觀察其同源性特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)：這5株HAdV相互之間的序列同源性為100%，應(yīng)屬于同一分型，與B2型HAdV基因組序列的同源性達(dá)到了97.9%，推測(cè)這5株HAdV序列應(yīng)該屬于B型HAdV，見(jiàn)表6。

表6 未明確分型HAdV序列類(lèi)型多序列比對(duì)結(jié)果Table 6 Multiple sequence alignment results of unverified HAdV genome

3 討論

人腺病毒是常見(jiàn)的傳染病原體，會(huì)引起呼吸道、胃腸道等疾病[12]。在過(guò)去幾十年里對(duì)于人腺病毒的研究不斷深入，對(duì)人腺病毒的治療也有了相應(yīng)的臨床方案。同時(shí)，人腺病毒也是很常用的基因載體，在臨床應(yīng)用方面經(jīng)常用于腫瘤基因治療[13]。

溶瘤腺病毒療法被認(rèn)為是有希望的新型抗癌療法，通過(guò)對(duì)腺病毒載體的改造，利用病毒特異性靶向殺死腫瘤細(xì)胞[14]。HAdV-C5型人腺病毒作為溶瘤腺病毒已廣泛用于癌癥的臨床治療中，有研究評(píng)估了15種不同人腺病毒對(duì)前列腺、腎臟腫瘤和骨肉瘤的溶瘤活性。在對(duì)20例臨床患者骨肉瘤病理切片觀察中發(fā)現(xiàn)B型溶瘤腺病毒對(duì)骨肉瘤細(xì)胞具有殺傷作用，同時(shí)抑制了骨肉瘤細(xì)胞的自噬過(guò)程，從而增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)化療的敏感度[8]。因此，B型HAdV作為溶瘤腺病毒在骨肉瘤治療方面具有較高的臨床應(yīng)用潛力。在人前列腺腫瘤的測(cè)試中，HAdV-C5型、HAdV-B11和HAdV-B35型人腺病毒在靜脈注射后造成了較嚴(yán)重的肝毒性，HAdV-C6型毒性相對(duì)較小，同時(shí)顯著延緩了腫瘤生長(zhǎng)[15]，說(shuō)明HAdV-C6型人腺病毒比HAdV-C5型、HAdV-B11和HAdV-B35型人腺病毒更適合于人前列腺腫瘤的溶瘤病毒治療。因此并不是所有類(lèi)型的人腺病毒都可以用于溶瘤病毒治療[9]，找出合適類(lèi)型的人腺病毒進(jìn)行抗癌治療是十分必要的。

本研究將11株未明確分型的完整HAdV基因組序列進(jìn)行分型，并找出適合做溶瘤腺病毒的病毒株。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示有6株未知的HAdV序列與參照HAdV序列有著很近的進(jìn)化關(guān)系，可以推測(cè)出這6株可能的分型。剩余5株在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上彼此之間的進(jìn)化關(guān)系很接近，但是與參照序列無(wú)明顯進(jìn)化關(guān)系，無(wú)法通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析來(lái)判別其類(lèi)型。

對(duì)之前已推測(cè)出可能類(lèi)型的HAdV序列與各自參照序列進(jìn)行多序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：KY002683和KY002684基因組序列與HAdV-B參照基因組序列之間的同源性為97.8%，綜合系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果判斷出這兩株HAdV應(yīng)該屬于B型HAdV；MH634393和KF302429基因組序列與HAdV-D參照基因組序列之間的同源性分別為92.7%和98.1%，推測(cè)這兩株HAdV應(yīng)該屬于D型HAdV；剩余兩株為MK570618和MK570619的HAdV與系統(tǒng)進(jìn)化分析得出的可能類(lèi)型的參照序列之間同源性較低，與進(jìn)化分析結(jié)果不一致，無(wú)法從基因?qū)用嫔吓袛喑鲞@兩株病毒的類(lèi)型，可能還需要進(jìn)一步對(duì)這兩株病毒株的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行相關(guān)分析才能判斷出其分型。

剩余5株HAdV基因組序列未能從系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果上推斷出病毒類(lèi)型，可能是由于HAdV之間本身的差異比較小，導(dǎo)致系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系比較接近，于是將這5株HAdV基因組序列與HAdV-AHAdV-F參照序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)這5株HAdV的序列與B型HAdV基因組序列的同源性達(dá)到了97.9%，推測(cè)這5株應(yīng)該屬于B型HAdV，這5株B型HAdV病毒株與之前分型的兩株B型HAdV病毒株可能適合作為溶瘤腺病毒進(jìn)行骨肉瘤治療的相關(guān)研究。

本文對(duì)2012—2019年在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的11株未分型HAdV病毒株的基因組序列進(jìn)行了初步研究，對(duì)其中9株病毒株進(jìn)行了分型，并找出7株可能適合作為溶瘤腺病毒的B型HAdV病毒株，為之后對(duì)未知HAdV病毒株的分型以及溶瘤腺病毒類(lèi)型的選擇提供了一定思路。