畢國善，張俠陵，劉輝，陳潔，羅東陽，熊國祚

（1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 血管外科，湖南 衡陽 421001；2.湖南省常德市第一人民醫(yī)院 心血管外科，湖南 常德 415000；3.湖南省益陽市中心醫(yī)院 血管外科，湖南 益陽 413000）

糖尿病下肢血管病變是糖尿病患者常見的并發(fā)癥之一[1]，約占糖尿病并發(fā)癥的20%，是導(dǎo)致患者截肢的主要原因，嚴(yán)重影響糖尿病患者的生命健康[2]。而目前無論藥物、外科轉(zhuǎn)流術(shù)以及介入治療遠(yuǎn)期療效都不能令人滿意[3-4]。近年來，通過促血管新生改善缺血部位血液循環(huán)，已成為治療糖尿病下肢缺血重要方法[5-7]。小凹蛋白1（caveolin-1）是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，通過分子表面的“腳手架”區(qū)能與多種信號分子相互作用，在多種疾病中起著重要調(diào)控作用[8-9]。有研究報道，caveolin-1可促進血管新生，并參與糖尿病病理過程[10-11]，筆者推測caveolin-1可能在糖尿病下肢缺血中發(fā)揮著重要作用，因此，本研究主要探討caveolin-1對糖尿病下肢缺血部位血管新生的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物80 只健康SD 大鼠，雄性，（200±20）g，8～10 周，從南華大學(xué)動物實驗部購買。

1.1.2 實驗儀器SZ-93 自動雙重純水蒸餾器（亞榮，上海）；三用恒溫水浴箱（中國）；Eppendorf 型高速離心機 （5804 型、5804R 德國）；ELX800 型酶標(biāo)儀（BioTEk，美國）；微量移液器（Select Bioproducts，美國）；OLYMPUS 顯微鏡與顯微攝像系統(tǒng)（BX51 型，日本）；Sartorius電子天平（BSA223S，美國）；Sanyo -80 ℃冰箱（日本）。

1.1.3 實驗試劑pCDNA3.1（+）caveolin-1（南華大學(xué)藥物藥理研究所贈送）；鏈脲菌素（STZ，Sigma，美國）；兔抗大鼠caveolin-1 抗體（博奧森生物，中國）；兔抗大鼠eNOS 抗體（博奧森生物，中國）；NO 檢測試劑盒（建成生物公司，中國）；DAB 顯色試劑盒（艾杰生物，中國）；檸檬酸三鈉（大茂化學(xué)，中國）；檸檬酸（大茂化學(xué)，中國）；青霉素（魯抗醫(yī)藥，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.11 型糖尿病大鼠模型建立根據(jù)文獻[12]方法，大鼠禁食12 h 后，將配好的STZ 溶液（0.l mol/L）經(jīng)腹腔快速注射入大鼠體內(nèi)，劑量為50 mg/kg。分別術(shù)后第3、7、14、21 天采尾靜脈血測空腹血糖，當(dāng)血糖濃度均高于16.8 mmol/L 為建模成功，最終有44 只大鼠造模成功。

1.2.2 實驗分組根據(jù)隨機化原則，將糖尿病模型大鼠分為4 組：假手術(shù)組、手術(shù)缺血組（模型組）、手術(shù)缺血空轉(zhuǎn)染組（空轉(zhuǎn)組）、缺血+caveilin-1轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染組），每組11 只。假手術(shù)組則僅將右側(cè)腹股溝皮膚切開，暴露股動脈后縫合，不離斷股動脈；模型組單純結(jié)扎離斷股動脈及分支；空轉(zhuǎn)染組在模型組的基礎(chǔ)上，通過尾靜脈注射不含caveolin-1 質(zhì)粒的脂質(zhì)體溶液；轉(zhuǎn)染組為股動脈離斷術(shù)后，從大鼠尾靜脈注射含caveolin-1 的質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染。

1.2.3 建立糖尿病大鼠急性下肢缺血模型建模方法：各組大鼠應(yīng)用3% 戊巴比妥鈉以（1.5 mL/Kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，將大鼠固定于手術(shù)臺，在右側(cè)腹股溝區(qū)做一2 cm 縱行切口，逐層分離并游離股動脈的上下端,除假手術(shù)組外，各組于股動脈起始部至股動脈末端結(jié)扎離斷，避免損傷并行的靜脈及神經(jīng)，依次縫合切口（圖1）。于術(shù)后14 d處死大鼠，取術(shù)側(cè)腓腸肌組織進行下一步檢測。

圖1 建立大鼠下肢缺血模型 A：分離股動脈；B：結(jié)扎股動脈及分支；C：術(shù)后大鼠出現(xiàn)肢體發(fā)紺Figure 1 Establishment of rat model of limb ischemia A:Separation of the femoral artery;B:Ligation of the femoral artery and the branches;C:Limb cyanosis after operation

1.2.4 Caveolin-1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法備好的質(zhì)粒和lipofectamineTM2000（Invitrogen，美國） 按1:3 的比例稀釋于2 個無血清培養(yǎng)基中，室溫靜置4 min 后兩者混合，再放置20 min 備用?？辙D(zhuǎn)染組：尾靜脈注射不含質(zhì)粒的脂質(zhì)體溶液；轉(zhuǎn)染組：通過尾靜脈注射含有caveolin-1 的質(zhì)粒的脂質(zhì)體溶液進行轉(zhuǎn)染；每只濃度為caveolin-15×109pfu。

1.2.5 ELISA 法檢測肌肉組織中NO 的表達術(shù)后14 d 處死各組大鼠后，取出右下肢腓腸肌組織搗碎，高速離心后取上清液100 μL，根據(jù)試劑盒說明書，采用硝酸還原酶法檢測一氧化氮（nitric oxide，NO）的含量，試驗重復(fù)3 次取平均值。

1.2.6 缺血組織標(biāo)本檢測術(shù)后第14 d 處死各組大鼠取右下肢腓腸肌標(biāo)本，剝離周圍的肌腱和脂肪組織進行 HE 染色；免疫組化檢測caveolin-1 和eNOS 蛋白的表達。用不同倍數(shù)光學(xué)顯微鏡（40、100、200 倍）觀察切片，選取5 個視野觀察肌纖維形態(tài)學(xué)變化，并拍照留下圖像。使用Image J1.52V 軟件對免疫組化樣本圖像進行分析，測其平均光密度值（average optical density，AOD）進行半定量分析。

1.2.7 微血管計數(shù)（MVD）腓腸肌組織進行CD34 免疫組化檢測，以染成棕黃色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為1 個血管計數(shù)，在低倍鏡下（40 倍）選擇微血管密度最高的3 個區(qū)域，在高倍鏡（200 倍）下計數(shù)微血管數(shù)，取其平均數(shù)為該標(biāo)本的微血管數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間的比較采用獨立樣本的t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

大鼠在注射STZ溶液后第3～4天開始出現(xiàn)飲水量、尿量、攝食量明顯增加，體質(zhì)量逐漸減輕、活動量降低、皮毛干燥無光澤。急性下肢缺血模型建立后，大鼠出現(xiàn)下肢皮膚溫度降低、紫紺等癥狀，大鼠后肢屈曲，走路不穩(wěn)，手術(shù)側(cè)肌肉肌肉萎縮，肌張力明顯弱于健側(cè)，在觀察期間轉(zhuǎn)染組和模型組各死亡1只大鼠，死亡原因考慮為糖尿病酮癥酸中毒和（或）切口感染所致。

2.2 HE 染色觀察腓腸肌組織形態(tài)及炎細(xì)胞浸潤情況

取各術(shù)側(cè)組腓腸肌組織進行HE染色，將玻片放入不同倍數(shù)的顯微鏡下觀察，腓腸肌細(xì)胞形無明顯充血水腫，模型組及空轉(zhuǎn)染組有多量炎癥細(xì)胞浸潤，且肌肉組織萎縮明顯，轉(zhuǎn)染組炎癥細(xì)胞浸潤較少，肌肉萎縮不明顯（圖2）。

圖2 各組腓腸肌組織HE 染色（×200） A：假手術(shù)組；B：模型組；C：空轉(zhuǎn)組；D：轉(zhuǎn)染組Figure 2 HE staining of gastrocnemius muscle tissue of each group(×200) A:Sham operation group;B:Model group;C:Empty transfection group;D:Transfection group

2.3 ELISA 檢測各組NO 表達變化

NO在各組均有一定程度的表達，其中模型組、空轉(zhuǎn)染組中的NO的表達低于假手術(shù)組（均P<0.01）；而轉(zhuǎn)染組NO水平明顯高于其他各組（均P<0.01），模型組與空轉(zhuǎn)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

表1 各組腓腸肌肌肉組織中NO 的濃度（±s）Table 1 Concentrations of NO in gastrocnemius muscle tissues of each group(±s)

表1 各組腓腸肌肌肉組織中NO 的濃度（±s）Table 1 Concentrations of NO in gastrocnemius muscle tissues of each group(±s)

注：1）與假手術(shù)組比較，P<0.01；2）與模型組比較，P<0.01Note:1)P<0.01 vs.sham operation group;2)P<0.01 vs.model group

組別nNO（μmol/L）假手術(shù)組1119.2476±1.89模型組1015.7433±1.341)空轉(zhuǎn)組1115.5737±1.371)轉(zhuǎn)染組1042.2661±3.561),2)

2.4 免疫組化染色檢測腓腸肌組織中caveolin-1和eNOS 的表達

P 染色法檢測各組腓腸肌組織中caveolin-1和eNOS的表達情況，并用Image J1.52V圖像分析軟件進行半定量分析。結(jié)果顯示，caveolin-1在各組均有表達，但轉(zhuǎn)染組標(biāo)本中caveolin-1蛋白的表達水平明顯高于其他各組（P<0.01）；而與假手術(shù)組比較，模型組、空轉(zhuǎn)染組caveolin-1蛋白的表達升高（P<0.01）；模型組與空轉(zhuǎn)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖3）（表2）。同樣方法檢測eNOS蛋白，結(jié)果顯示，假手術(shù)組、空轉(zhuǎn)染組和模型組的eNOS表達無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而轉(zhuǎn)染組的eNOS表達明顯高于各組（P<0.01）（圖4）（表3）。

圖3 各組腓腸肌組織caveolin-1 免疫組化染色（×100） A：假手術(shù)組；B：模型組；C：空轉(zhuǎn)組；D：轉(zhuǎn)染組Figure 3 Immunohistochemical staining for caveolin-1 in the gastrocnemius muscle tissues in each group(×100) A:Sham operation group;B:Model group;C:Empty transfection group;D:Transfection group

表2 免疫組化檢測各組腓腸肌組織中caveolin-1 AOD 值（±s）Table 2 AOD values of immunohistochemical staining for caveolin-1 in the gastrocnemius muscle tissues of each group(±s)

表2 免疫組化檢測各組腓腸肌組織中caveolin-1 AOD 值（±s）Table 2 AOD values of immunohistochemical staining for caveolin-1 in the gastrocnemius muscle tissues of each group(±s)

注：1）與假手術(shù)組比較，P<0.01；2）與模型組比較，P<0.01Note:1)P<0.01 vs.sham operation group;2)P<0.01 vs.model group

組別ncaveolin-1 AOD假手術(shù)組11140.9326±2.8504模型組10153.3185±2.35961)空轉(zhuǎn)組11159.1245±3.21221)轉(zhuǎn)染組10171.0315±3.37381),2)

圖4 免疫組化檢測各組腓腸肌組織中eNOS 表達（×100） A：假手術(shù)組；B：模型組；C：空轉(zhuǎn)組；D：轉(zhuǎn)染組Figure 4 Immunohistochemical staining for eNOS in the gastrocnemius muscle tissues in each group(×100) A:Sham operation group;B:Model group;C:Empty transfection group;D:Transfection group

表3 免疫組化檢測各組腓腸肌組織中eNOS AOD 值（±s）Table 3 AOD values of immunohistochemical staining for eNOS in the gastrocnemius muscle tissues of each group(±s)

表3 免疫組化檢測各組腓腸肌組織中eNOS AOD 值（±s）Table 3 AOD values of immunohistochemical staining for eNOS in the gastrocnemius muscle tissues of each group(±s)

注：1）與假手術(shù)組比較，P<0.01；2）與模型組比較，P<0.01Note:1)P<0.01 vs.sham operation group;2)P<0.01 vs.model group

組別neNOS AOD 值假手術(shù)組11140.2806±2.0644模型組10138.3015±2.3596空轉(zhuǎn)組11139.1245±3.2122轉(zhuǎn)染組10171.0315±3.37381),2)

2.5 CD34 免疫組化檢測腓腸肌組織中MVD

免疫組化檢測各組腓腸肌組織中CD34的表達并計數(shù)MVD，與假手術(shù)組比較，模型組及空轉(zhuǎn)組棕褐色顆粒增加，CD34的表達量明顯增加（均P<0.01）；與模型組比較，轉(zhuǎn)染組，CD34的表達量明顯增加（P<0.01），模型組與空轉(zhuǎn)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖5-6）。

圖5 CD34 免疫組化檢測各組腓腸肌組織中MVD（×200） A：假手術(shù)組；B：模型組；C：空轉(zhuǎn)組；D：轉(zhuǎn)染組Figure 5 Immunohistochemical staining for CD34 marked MVD in the gastrocnemius muscle tissues of each group(×200) A:Sham operation group;B:Model group;C:Empty transfection group;D:Transfection group

圖6 各組腓腸肌組織中CD34 標(biāo)記的MVD 比較Figure 6 Comparison of the values of CD34 marked MVD in the gastrocnemius muscle tissues among groups

3 討論

糖尿病下肢血管病變是由于機體內(nèi)長期處于高血糖環(huán)境，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的的脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性及炎性損傷，誘導(dǎo)動脈粥樣硬化、中小動脈血栓形成最終導(dǎo)致血管狹窄或閉塞[13-15]。研究顯示，糖尿病患者合并有下肢血管病變者高達50%以上[16]，其截肢率是非糖尿病患者的15～30倍[17-18]。而目前手術(shù)及藥物治療糖尿病下肢血管病變的效果并不理想[19]。因此，如何促進糖尿病肢體血液循環(huán)，改善患者生活質(zhì)量，降低致死致殘率發(fā)生，是臨床急需解決的問題。

caveolin-1是小凹（caveolae）表面的信號傳遞蛋白能，誘導(dǎo)多種信號蛋白的活化或沉默，廣泛表達于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞中，在心血管疾病中發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)[20-21]。研究[22]表明，機體出現(xiàn)組織缺血時caveolin-1的高表達可促進血管新生，并對組織缺血、血流再灌注發(fā)揮有益的效應(yīng)。Jasmin等[23]發(fā)現(xiàn)，將被敲除caveolin-1基因的大鼠結(jié)扎股動脈后缺血明顯加重，肢體出現(xiàn)不可逆的壞死，而提高caveolin-1基因表達后血管再生能力則恢復(fù)，下肢缺血得以改善。另外，caveolin-1還參與了糖尿病病變過程，敲除了大鼠caveolin-1基因后，大鼠的血糖明顯增高，組織中胰島素受體水下降可高達90%的[24]。而caveolin-1在糖尿病下肢缺血中的作用如何，目前較少報道，實驗通過結(jié)扎股動脈建立糖尿病大鼠下肢缺血模型，轉(zhuǎn)染caveolin-1使其高表達，結(jié)果顯示caveolin-1轉(zhuǎn)染后微血管形成增多，肢體缺血緩解，提示caveolin-1在糖尿病下肢缺血中可誘導(dǎo)血管新生，改善局部血流灌注。

NO是機體內(nèi)一種作用廣泛的氣信號分子，可調(diào)節(jié)血管舒縮[25]，抑制血小板聚集[26]，促進血管新生[27]，減輕氧化應(yīng)激損傷[28]，是重要血管保護因子。NO是由內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）催化左旋精氨酸和氧反應(yīng)生成，eNOS/NO信號通路在血管新生過程中起著多重促進效應(yīng)[29-30]。有研究[31]表明，NO的生成及利用率降低引起內(nèi)皮依賴性血管舒張因子功能障礙是糖尿病周圍血管病變重要原因。Caveolin-1是eNOS的“分子伴娘”，eNOS位于caveolae內(nèi)并與caveolin-1結(jié)合形成復(fù)合體[32]，caveolin-1可以促進AKT的磷酸化，使其eNOS 發(fā)生絲氨酸磷酸化，從而增加 NO的生成[33]。那么caveolin-1促進糖尿病大鼠下肢缺血部位血管新生是否與eNOS/NO通路相關(guān)？從實驗圖5可以發(fā)現(xiàn)，糖尿病下肢缺血大鼠轉(zhuǎn)染caveolin-1后，eNOS和NO表達明顯升高，說明caveolin-1在糖尿病下肢缺血模型中促進血管新生作用是通過活化eNOS促進NO表達其作用。但是，本實驗存在很多不足，如僅僅在動物水平闡述caveolin-1對糖尿病下肢缺血大鼠的作用，缺乏細(xì)胞水平及其更加詳細(xì)的分子機制研究，我們將在后續(xù)工作中進一步完成。

綜上所述，caveolin-1的高表達在糖尿病大鼠下肢缺血部位具有促進血管新生的作用，其機制可能與活化eNOS/NO通路有關(guān)，但其具體分子機制仍需進一步研究。