劉郁 張靜靜 呂榮祥 王文盛

早發(fā)性帕金森?。╡arly-onset Parkinson’s dis?ease，EOPD）是一種與年齡有關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，可于50歲前出現(xiàn)首發(fā)癥狀[1,2]，且EOPD具有特殊的臨床特征[3]，目前區(qū)分EOPD 和晚發(fā)性帕金森?。╨ate-onset Parkinson’s disease，LOPD）的分子檢測(cè)手段仍有限[4]。本次研究比對(duì)分析EOPD 和LOPD 患者中血清胞外囊泡的差異表達(dá)miRNAs 水平[5]，借助生物信息工具挖掘其靶基因及網(wǎng)絡(luò)互作?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018 年2月至2019 年12月于寧波市第六醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的帕金森病患者18例，其中男性10例、女性8例；年齡42～73歲，平均年齡（52.21±3.24）歲。所有患者均符合帕金森病診斷標(biāo)準(zhǔn)（2016 版中國(guó)帕金森病診斷標(biāo)準(zhǔn)）[6]；排除標(biāo)準(zhǔn)為：①已知原因引起的繼發(fā)性帕金森病，如藥物、創(chuàng)傷或其他腦血管疾??；②有自身免疫性疾病或其他系統(tǒng)性疾?。虎劢诮邮苓^(guò)藥物治療；④既往嚴(yán)重基礎(chǔ)性疾??；⑤患有精神類疾病，不能夠配合研究。根據(jù)患者起病年齡，將患者分為EOPD 組（≤50歲）7例和LOPD 組（＞50歲）11例。EOPD 組男性4例、女性3例；平均年齡（55.29±10.03）歲；LOPD組男性6例、女性5例，平均年齡（50.27±3.60）歲。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 胞外囊泡RNA 提取 用血清管收集受試者患者外周血5 ml，在離心機(jī)上以1 500 r/min 離心5 min 后收集血清。采用exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit 試劑盒（由德國(guó)QIAGEN 公司生產(chǎn)）通過(guò)膜親和離心柱血清胞外囊泡。將預(yù)先過(guò)濾的血清與Buffer XBP 進(jìn)行混合并結(jié)合在exoEasy 膜親和離心柱上。對(duì)結(jié)合的囊泡小體使用Buffer XWP 進(jìn)行清洗，并使用400 μl Buffer XE 進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。參考生產(chǎn)商說(shuō)明，采用該試劑盒對(duì)血清囊泡中總RNA進(jìn)行提取，并保存在-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 胞外囊泡miRNA 水平 根據(jù)PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索已報(bào)道與EOPD 相關(guān)的異常表達(dá)miRNAs，遴選出11個(gè)相關(guān)的miRNAs（miR-1、miR-22、miR-29a、miR-331-5p、miR-141、miR-146b-5p、miR-193a-3p、miR-214、miR-103a、miR-30b、miR-3134）[7]。血清樣本提取的胞外囊泡RNA經(jīng)定量后，采用qRT-PCR方法分析miRNAs 相對(duì)水平。根據(jù)miRNA第一鏈cDNA合成加尾法逆轉(zhuǎn)錄RNA。將cDNA用作RT-PCR模板，使用MaximaTMSYBR Green qPCR Master Mix試劑（由美國(guó)Applied Biosystems 生產(chǎn)），ABI 7500 實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)系統(tǒng)（由美國(guó)Applied Biosystems 生產(chǎn)）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。miRNA 引物由Invitrogen 公司（由美國(guó)Thermo Fisher Scientific 生產(chǎn)）合成。所有反應(yīng)獨(dú)立重復(fù)3次，U6 作為內(nèi)對(duì)照，以2－△△ct進(jìn)行相對(duì)定量分析，以確定囊泡miRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。將差異表達(dá)最顯著的miRNA 做為研究對(duì)象，研究其可能的生物學(xué)功能。

1.2.3 miRNA 靶基因的本體分析（gene ontology，GO）在TargetScan 數(shù) 據(jù)庫(kù)（http：//www.targetscan.org/vert_72/）輸入篩選miRNA 后下載靶基因數(shù)據(jù)，使用String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）對(duì)Cumula?tive weighted context score＜-0.2 的靶基因進(jìn)行GO分析，找到與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的靶基因，并分析這些基因所參與的生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞成分，以P＜0.05表示結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein in?teraction，PPI）和關(guān)鍵靶基因篩選使用String 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的靶基因構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，使用R 軟件統(tǒng)計(jì)各基因間蛋白質(zhì)相互作用節(jié)點(diǎn)數(shù)，并篩選節(jié)點(diǎn)數(shù)最多的前20個(gè)基因與神經(jīng)元成分相關(guān)基因取交集以篩選關(guān)鍵靶基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 及GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異miRNAs 在LOPD 和EOPD 患者血清胞外囊泡中的表達(dá)水平見(jiàn)圖1

圖1 差異miRNAs在LOPD和EOPD患者血清胞外囊泡中的表達(dá)水平

由圖1 可見(jiàn)，miR-214、miR-30b、miR-141、miR-146b-5p、miR-193a-3p、miR-331-5p 在兩組患者血清胞外囊泡中存在表達(dá)差異，與LOPD 組患者相比，EOPD 患者的miR-214、miR-30b、miR-141 及miR-146b-5p 表達(dá)下調(diào)（t分別=-7.12、-6.84、-3.61、-3.52，P均＜0.05），而miR-193a-3p 和miR-331-5p表達(dá)上調(diào)（t分 別=23.14、25.22，P均＜0.05），miR-331-5p 在所有差異表達(dá)的miRNAs 中變化水平最顯著。

2.2 miR-331-5p 靶基因GO 分析 TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得miR-331-5p 靶基因數(shù)2 235，String 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO分析，見(jiàn)表1～3。

表1 神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的生物學(xué)過(guò)程分析

由表1 可見(jiàn)，靶基因主要參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)形成、神經(jīng)元產(chǎn)生以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程，其中181個(gè)靶基因與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)。

由表2 可見(jiàn)，其靶基因主要功能是參與蛋白質(zhì)結(jié)合及DNA連接。

表2 神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的分子功能分析

由表3 可見(jiàn)，靶基因主要參與神經(jīng)元、軸突、樹(shù)突和突觸的組成。

表3 神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的細(xì)胞成分分析

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖、節(jié)點(diǎn)數(shù)統(tǒng)計(jì)及基因交集 應(yīng)用String 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)181個(gè)與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育靶基因進(jìn)行PPI分析，并對(duì)整個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)數(shù)最多的前20個(gè)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)圖2～3。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

由圖3 可見(jiàn)，在整個(gè)PPI 網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)數(shù)最多的前20個(gè)基因分別是TP53、MAPK3、MAPK1、HSP90AA1、BCL2、KRAS、NRAS、PTEN、RHOA、HGF、HDAC9、JAK2、LYN、SMAD4、HDAC4、RUNX2、FGFR2、IRS2、HIF1A 以及GDNF，進(jìn)一步對(duì)上述基因和GO分析結(jié)果中作為神經(jīng)元細(xì)胞成分的38個(gè)關(guān)鍵基因取交集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTEN和MAPK1既是miR-331-5p的關(guān)鍵靶基因，又參與調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞組成。

圖3 miR-331-5p靶基因構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)數(shù)最多的前20個(gè)基因

3 討論

帕金森病是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，根據(jù)發(fā)病年齡可將其分為EOPD 和LOPD，兩組患者具有不同的生物學(xué)背景。Pandey 等[8]用PCR-Sanger 測(cè)序法發(fā)現(xiàn)基因PRKN 在80%EOPD 患者中為雜合變異，而在尼日利亞Milanowski 等[9]發(fā)現(xiàn)PRKN、PINK1、DJ1、SNCA、LRRK2 在EOPD 患者中異常，張長(zhǎng)國(guó)等[10]發(fā)現(xiàn)清除幽門(mén)螺桿菌能改善帕金森病患者運(yùn)動(dòng)功能，以上這些證據(jù)表明：種族、家族史、遺傳學(xué)改變及環(huán)境因素是EOPD 發(fā)生的危險(xiǎn)因素，但其發(fā)病原因及機(jī)制尚未完全明確，需進(jìn)一步探索。

目前發(fā)現(xiàn)EOPD 與LOPD 患者的腦組織[11]、腦脊液[12]及外周血[13]中miRNAs 表達(dá)存在差異，然而對(duì)胞外囊泡miRNA 的差異表達(dá)研究十分有限。血清胞外囊泡中miRNAs 穩(wěn)定性好、不易降解，有較好臨床應(yīng)用前景[14,15]，已成為多種疾病診斷及預(yù)后研究熱點(diǎn)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)外周血游離11個(gè)經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道差異表達(dá)miRNAs 中，僅有6個(gè)miRNAs（miR-193a-3p、miR-214、miR-30b、miR-331-5p、miR-141、miR-146-5p）在血清胞外囊泡中存在同樣差異，且除miR193a-3p 外，其余5個(gè)miRNA 變化趨勢(shì)一致，運(yùn)用生物信息學(xué)重點(diǎn)挖掘181個(gè)與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的miR-331-5p 靶基因，GO分析發(fā)現(xiàn)這些靶基因參與神經(jīng)調(diào)節(jié)的多個(gè)方面，如調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，調(diào)控神經(jīng)元、軸突、樹(shù)突及突觸生成，此外靶基因還參與蛋白質(zhì)及DNA 間連接。本研究結(jié)合PPI 網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PTEN和MAPK1既是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育互作最顯著基因，又參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元組成。PTEN 是胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)因子，其在帕金森病患者腦組織中表達(dá)水平顯著升高，降低PTEN 核蓄積可改善帕金森病患者的神經(jīng)退行性變[17]，MAPK 激活可阻止神經(jīng)元死亡[18]。事實(shí)上，PTEN 能抑制接頭蛋白磷酸化及對(duì)MAPK 通路上游的RAS 活化。由于帕金森病發(fā)生發(fā)展與大腦神經(jīng)元損傷密切相關(guān)[19]，而胞外囊泡又易穿透血腦屏障將分子特異遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)[20]，因此推測(cè)胞外囊泡miR-331-5p 很可能通過(guò)靶向MAPK1與PTEN參與EOPD進(jìn)展調(diào)節(jié)。

綜上所述，EOPD 患者血清胞外囊泡中miR-331-5p 相對(duì)水平明顯高于LOPD 患者，初步揭示了MAPK1 和PTEN 為其關(guān)鍵靶基因，胞外囊泡miR-331-5p 可能通過(guò)上述基因參與EOPD 發(fā)生與發(fā)展，但存在一定的局限性，仍需要大樣本的體內(nèi)和體外驗(yàn)證及采用全外顯子測(cè)序技術(shù)進(jìn)行深度的分子機(jī)制研究。