聞鄭峰 呂友 林兆奮

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory dis?tressed syndrome，ARDS）是嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等肺內(nèi)外因素作用后出現(xiàn)的以進(jìn)一步呼吸窘迫和難治性低氧血癥為臨床特點(diǎn)的綜合征[1]。雖然ARDS 在機(jī)械通氣治療取得重大進(jìn)展，但患者住院死亡率仍高達(dá)40%[2]。全氟化碳具有良好的溶解非極性氣體的功能，可以作為氧氣和二氧化碳的運(yùn)載體[3]，而二棕櫚酸卵磷脂是肺表面活性物質(zhì)的主要成分，既可修飾全氟化碳制成全氟化碳乳劑，又能夠提供肺表面活性物質(zhì)起到改善肺順應(yīng)性的作用。本次研究擬通過(guò)油酸誘導(dǎo)家兔ARDS 模型，觀察富氧全氟化碳乳劑治療該ARDS模型的療效情況?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2019 年6 月至2020 年5 月，實(shí)驗(yàn)在海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院急救醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。選擇健康成年新西蘭家兔18 只，體重約2 kg 左右，性別不限，由海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前晚禁食不禁水。家兔隨機(jī)分為：油酸+乳劑組、油酸組和對(duì)照組，每組6 只家兔。三組一般資料等比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 新西蘭家兔常規(guī)稱重，由耳緣靜脈注入按戊巴比妥鈉（由Sigma 公司生產(chǎn)）30 mg/kg 給藥。麻醉起效后，常規(guī)動(dòng)靜脈置管，用于抽血?dú)夥治龊徒o藥。外科操作結(jié)束后穩(wěn)定30 min，油酸組和油酸+乳劑組采用油酸制備ARDS 模型，油酸（由Sigma 公司生產(chǎn)）按0.1 ml/kg 從耳緣靜脈內(nèi)在5 min 內(nèi)分3 次勻速注射完畢，對(duì)照組注入相同劑量的0.9%氯化鈉注射液；30 min 后反復(fù)測(cè)動(dòng)脈血?dú)夥治?，將氧合指?shù)≤300 mmHg 且持續(xù)30 min 以上作為ARDS 模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 當(dāng)造模成功時(shí)，油酸+乳劑組霧化吸入富氧全氟化碳乳劑（由上海納米技術(shù)及應(yīng)用國(guó)家工程研究中心提供）15 min（全氟化碳乳劑霧化前先通氧氣10 min），油酸組霧化吸入等量0.9%氯化鈉注射液。觀察和記錄基線、成模、霧化吸入完成后0 min、5 min、15 min、30 min、60 min、120 min、240 min、360 min 時(shí)的血氧分壓（partial pressure of oxygen，PaO2），比較三組在霧化吸入結(jié)束后360 min 時(shí)血清和肺灌洗液中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的濃度。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)處死家兔，肺組織經(jīng)過(guò)蘇木精-伊紅染色，采用Smith評(píng)分法[4]評(píng)價(jià)肺損傷程度。肺系數(shù)=肺質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。實(shí)驗(yàn)取左上肺作肺泡灌洗，取血清和肺泡灌洗液上清液檢測(cè)總蛋白含量，計(jì)算肺通透指數(shù)。肺通透指數(shù)=肺泡灌洗液總蛋白/血清總蛋白。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組家兔的PaO2變化比較見(jiàn)表1

表1 三組家兔的PaO2變化比較/mmHg

由表1 可見(jiàn)，在霧化吸入富氧全氟化碳乳劑結(jié)束后0 min 和360 min，油酸+乳劑組的PaO2高于油酸組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=2.56、2.30，P均＜0.05），但在霧化結(jié)束后5 min，兩者的PaO2比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.06，P＞0.05）。在造模成功后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，油酸+乳劑組和油酸組的PaO2均低于對(duì)照組（t分別=16.66、16.73、8.50、14.17、6.89、10.71、9.24、10.03、10.28、10.10、5.95、7.87、4.99、6.07、3.48、4.15、2.92、7.22,P均＜0.05）。

2.2 三組家兔的Smith 肺損傷評(píng)分、肺系數(shù)、肺通透指數(shù)比較見(jiàn)表2

由表2 可見(jiàn)，在霧化吸入結(jié)束后360 min，油酸+乳劑組的Smith 肺損傷評(píng)分和肺系數(shù)低于油酸組（t分別=2.56、2.34，P均＜0.05）。油酸組+乳劑組和油酸組的Smith 肺損傷評(píng)分、肺系數(shù)和肺通透指數(shù)均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=19.50、26.77、7.97、8.14、4.10、2.70,P均＜0.05）。

表2 三組家兔的Smith肺損傷評(píng)分、肺系數(shù)、肺通透指數(shù)比較

2.3 三組家兔血清和支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β的濃度比較見(jiàn)表3

表3 三組家兔血清和支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β的濃度比較/pg/ml

由表3 可見(jiàn)，在霧化吸入結(jié)束后360 min，油酸+乳劑組和油酸組血清中的TNF-α濃度均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=4.34、2.45，P均＜0.05）。雖然油酸+乳劑組血清和肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-1β 濃度高于油酸組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=0.92、0.52、0.82、0.38，P均＞0.05）。油酸+乳劑組和油酸組肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-1β濃度均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=6.44、2.82、4.21、2.24，P均＜0.05）。

2.4 三組家兔的肺組織大體標(biāo)本外觀比較 油酸+乳劑組家兔的肺表面可見(jiàn)小片狀出血和壞死灶，橫切面和氣管內(nèi)可見(jiàn)少量粉紅色泡沫狀液體流出。油酸組家兔的肺表面可見(jiàn)片狀出血和壞死灶，有明顯充血水腫，體積較對(duì)照組明顯增大，橫切面和氣管內(nèi)可見(jiàn)大量粉紅色泡沫狀液體流出；對(duì)照組家兔的肺呈淡粉紅色，橫切面未見(jiàn)明顯泡沫樣液體流出。

2.5 三組家兔的肺組織光鏡結(jié)果見(jiàn)封三圖4

圖4 三組家兔的肺組織光鏡結(jié)果（蘇木精-伊紅染色，×200倍）

由封三圖4 可見(jiàn)，油酸+乳劑組家兔的肺泡內(nèi)可見(jiàn)中等量的粉紅色水腫液和炎癥細(xì)胞，血管和肺泡內(nèi)可見(jiàn)少量淤血，并有少部分肺泡萎陷。油酸組家兔的肺泡內(nèi)可見(jiàn)大量淡粉色水腫液，肺泡中可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞，血管及肺泡中可見(jiàn)大量淤血，部分肺泡萎縮或消失。對(duì)照組家兔的肺組織表現(xiàn)正常，但部分區(qū)域可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 討論

ARDS 的主要病理生理基礎(chǔ)是肺泡及肺毛細(xì)血管的彌漫性損傷導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡以及肺表面活性物質(zhì)的缺乏，進(jìn)而出現(xiàn)肺水腫、肺不張、通氣血流比例失調(diào)，最終導(dǎo)致頑固性的低氧血癥。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，全氟化碳是一類化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、無(wú)毒、無(wú)味、不溶于水的化合物，具有低張力和良好氣溶性特征，因此具有抗炎、表面活性物質(zhì)樣作用[5,6]。同時(shí)，選擇以二棕櫚酸卵磷脂為主要成分的人工肺表面活性物質(zhì)作為載體，通過(guò)補(bǔ)充肺表面活性物質(zhì)起到降低肺表面張力，防止肺泡塌陷，以提高肺的通氣功能。本次實(shí)驗(yàn)采用納米技術(shù)以二棕櫚酸卵磷脂為載體包裹全氟化碳制備全氟化碳乳劑。

本次實(shí)驗(yàn)采用油酸制備ARDS 模型，結(jié)果可見(jiàn)油酸組+乳劑組和油酸組的Smith 肺損傷評(píng)分、肺系數(shù)和肺通透指數(shù)均高于對(duì)照組（P均＜0.05），可能和油酸導(dǎo)致肺泡-毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷進(jìn)而出現(xiàn)肺血管通透性增強(qiáng)以及肺水腫的發(fā)生相關(guān)。同時(shí)可見(jiàn)油酸+乳劑組和油酸組血清中的TNF-α 濃度和肺泡灌洗液中的TNF-α、IL-1β 濃度均高于對(duì)照組（P均＜0.05），但總體上升不多，主要和油酸ARDS 模型是一種不完全依賴于炎癥細(xì)胞及其活性產(chǎn)物的模型相關(guān)。并且制模成功后PaO2迅速下降，并在一段時(shí)間內(nèi)較穩(wěn)定，結(jié)合光鏡下肺組織的改變，表明已達(dá)到ARDS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，提示由油酸制備ARDS模型是可靠穩(wěn)定的。本次實(shí)驗(yàn)觀察富氧全氟化碳乳劑對(duì)油酸誘導(dǎo)ARDS 模型的影響，并探究其可能機(jī)制。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在霧化吸入全氟化碳乳劑結(jié)束后0 min，油酸+乳劑組的PaO2較油酸組迅速改善，這可能與全氟化碳乳劑中氧氣的迅速釋放密切相關(guān)，但療效在用藥結(jié)束后5 min 消失，其原因很可能與用藥劑量較小，攜帶氧氣不多相關(guān)。同時(shí)在霧化吸入全氟化碳乳劑結(jié)束后360 min，油酸+乳劑組的PaO2較油酸組明顯改善，結(jié)合相關(guān)研究結(jié)果，其主要原因與全氟化碳乳劑能夠均勻分布于肺泡表面，促進(jìn)萎陷肺泡復(fù)張、改善通氣血流比有一定關(guān)系[7]。以上結(jié)果證明富氧全氟化碳乳劑能夠在短期和長(zhǎng)期情況下改善ARDS家兔的氧合狀態(tài)。

既往實(shí)驗(yàn)表明，全氟化碳對(duì)于炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用[8]。其主要機(jī)制是全氟化碳可降低炎癥因子釋放，能夠減輕中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，能夠抑制趨化因子mRNA 表達(dá)，并且能夠減少黏附分子的表達(dá)[9]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，油酸組和油酸+乳劑組的血清和肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β 濃度差異不大。這可能和油酸造模機(jī)制相關(guān)，首先油酸造模主要機(jī)制是損傷肺泡-毛細(xì)血管內(nèi)皮，是一種不完全依賴于炎癥細(xì)胞及其活性產(chǎn)物的急性肺損傷模型[10]，其次油酸型急性肺損傷主要機(jī)制是氧化應(yīng)激反應(yīng)、促凝血活性增高、內(nèi)皮素作用等[11]，所以可能油酸導(dǎo)致炎癥因子的改變不明顯，特別是在血液中。另外，本次實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)相關(guān)文獻(xiàn)中全氟化碳霧化吸入劑量較大，約6 ml·kg-1·h-1，持續(xù)2 h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本次研究的用量，所以本次研究可能導(dǎo)致炎癥因子變化不明顯。因此，考慮可能建立內(nèi)毒素誘導(dǎo)的ARDS模型研究全氟化碳抑制炎癥反應(yīng)效果會(huì)更加的顯著。

綜上所述，富氧全氟化碳乳劑可以改善油酸誘導(dǎo)ARDS 家兔的氧合情況以及減輕肺部組織損傷，其機(jī)制可能與富氧全氟化碳乳劑能夠輸送氧氣、補(bǔ)充肺表面活性物質(zhì)相關(guān)；另一方面，全氟化碳乳劑由全氟化碳和人工肺表面活性物質(zhì)合成，但具體由哪種物質(zhì)起主導(dǎo)作用尚不清楚，可通過(guò)建立霧化吸入人工肺表面活性物質(zhì)組進(jìn)一步研究。