毛丹丹 呂堯 揭園慶 戴偉民 黃強(qiáng)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的致死性極高，嚴(yán)重影響人們的日常生活，其病死率已經(jīng)占到膠質(zhì)瘤的50%以上[1]。替莫唑胺可以通過(guò)干預(yù)機(jī)體內(nèi)DNA 的復(fù)制等方式來(lái)促使疾病相關(guān)細(xì)胞凋亡[2,3]。臨床上使用替莫唑胺治療可以實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，從而提高腫瘤疾病患者的生存時(shí)間。臨床上替莫唑胺耐藥性的發(fā)生會(huì)大大降低其治療效果[4,5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）SNHG1 作為一個(gè)致癌基因，可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并且抑制其細(xì)胞凋亡[6]。雖然目前對(duì)于lncRNA 在癌細(xì)胞增殖方面的機(jī)制很多，但關(guān)于SNHG1 在替莫唑胺誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞方面的機(jī)制研究還鮮有報(bào)道。本研究主要探討SNHG1 對(duì)替莫唑胺誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞血管生成能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、正常腦膠質(zhì)細(xì)胞（由上海復(fù)祥生物科技有限公司生產(chǎn)）、胎牛血清（由上海碧云天公司生產(chǎn)）、DMEM 培養(yǎng)基（由美國(guó)HyClone 生產(chǎn)）、轉(zhuǎn)染試劑Li-pofectamineTM2000（由美國(guó)Invitrogen 生產(chǎn)）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（由北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）、胎牛血清（由美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)）、SNHG1 siRNA 及其陰性對(duì)照（由廣州復(fù)能基因有限公司生產(chǎn)）等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 替莫唑胺的濃度調(diào)配為1 000 μmol/L的母液。腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到融合度80%后，用替莫唑胺干預(yù)U251細(xì)胞24 h，進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)替莫唑胺誘導(dǎo)成功后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的人的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 分為：空白對(duì)照組、si-SNHG1 組（轉(zhuǎn)染si-SNHG1）、si-SNHG1NC組（轉(zhuǎn)染si-SNHG1-NC）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種在6 孔板中，細(xì)胞增長(zhǎng)至約70%融合時(shí)行轉(zhuǎn)染，磷酸緩沖鹽溶液洗滌2 次之后每孔加入1 ml的DMEM高糖培養(yǎng)基（含20%胎牛血清）。用去離子水溶解siRNA至20 μmol/L，將siRNA與500 μl 無(wú)血清DMEM 混勻后靜置，此為A 管，將轉(zhuǎn)染試劑Li-pofectamineTM2000 與無(wú)血清DMEM混勻后靜置，此為B 管，然后將A、B 管混勻靜置20 min 后加入各孔中，培養(yǎng)4～6 h 后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24～28 h。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)到50%即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè)SNHG1 的表達(dá)情況 取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，提取細(xì)胞及組織中的總RNA，定量后據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，再依RT-PCR試劑盒操作完成SNHG1的檢測(cè)，將GAPDH作為SNHG1 的內(nèi)參，通過(guò)2-△△ct公式計(jì)算其表達(dá)情況。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 將細(xì)胞接種至96 孔板，每孔的密度為1.0×103個(gè)細(xì)胞。于細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的0 h、24 h、48 h、72 h 時(shí)加入10 μl 的CCK-8 試劑，2 h 后在酶標(biāo)儀上測(cè)吸光度（optical density，OD）450值。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移侵襲能力 收集培養(yǎng)SNHG1 的細(xì)胞，置于無(wú)血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，接種至Transwell 小室上層，等風(fēng)干后加入500 μl 0.1%結(jié)晶紫染色，于顯微鏡下拍照并計(jì)算遷移的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞的侵襲實(shí)驗(yàn)需要在Transwell小室上層加入50 μl 2.0 mg/ml 基質(zhì)膠Matrigel，等其凝固后接種SNHG1 的細(xì)胞，之后的操作同細(xì)胞遷移。

1.2.6 小管形成實(shí)驗(yàn) 取6 代內(nèi)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件同1.2.1 下細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)基取干擾SNHG1 表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤的培養(yǎng)上清，1 500 r/min 離心10 min，1∶1 與DMEM 混勻。鋪膠在冰盒上進(jìn)行，1∶1 和DMEM 培養(yǎng)基稀釋，混勻后，每孔80 μl 加入24 孔板，37 ℃細(xì)胞孵箱放1 h 后，每孔鋪2×104個(gè)細(xì)胞，加入預(yù)配的培養(yǎng)基，后放入孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞成管后在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascu?lar endothelial growth factor，VEGF）選取經(jīng)轉(zhuǎn)染的后腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，37 ℃放置90 min；每個(gè)孔中加入100 μl 生物素化的抗體工作液，于37 ℃下放置1 h；每個(gè)孔中加入100 μl酶結(jié)合工作液，37 ℃放置30 min ；每個(gè)孔中加入90 μl TMB 底物溶液，37 ℃下避光放置15 min 左右；然后每個(gè)孔中加50 μl 終止液；測(cè)量各孔的OD 值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后進(jìn)行計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）來(lái)表示，用t檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組中SNHG1 的表達(dá) 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中SNHG1 的表達(dá)為0.06±0.05，明顯高于正常腦膠質(zhì)細(xì)胞中SNHG1的表達(dá)（0.01±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.24，P＜0.05）；腦膠質(zhì)瘤組織中LINC00337的表達(dá)為0.06±0.06，明顯高于正常腦膠質(zhì)組織中LINC00337 的表達(dá)（0.01±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.46，P＜0.05）。

2.2 各組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力比較見(jiàn)圖1

圖1 各組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力

由圖1 可見(jiàn)，si-SNHG1 組在48 h 和72 h 時(shí)細(xì)胞的增殖能力明顯低于si-SNHG1NC 組和空白對(duì)照組（t分別=17.29、16.86；8.20、11.60，P均＜0.05）。

2.3 各組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲比較見(jiàn)封二圖1～2

由封二圖1～2可見(jiàn)，si-SNHG1 組的遷移和侵襲能力較空白對(duì)照組和si-SNHG1NC組明顯下降。

圖1 各組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移比較（結(jié)晶紫染色，×200倍）

圖2 各組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲比較（結(jié)晶紫染色，×200倍）

2.4 各組的小管形成能力比較見(jiàn)封二圖3由封二圖3可見(jiàn)，si-SNHG1 組的小管形成能力明顯高于si-SNHG1NC組和空白對(duì)照組。

圖3 各組的小管形成能力比較（×200倍）

2.5 各組中VEGF的表達(dá)見(jiàn)表2

表2 各組中VEGF的表達(dá)/pg/ml

由表2 可見(jiàn)，VEGF 在si-SNHG1 組中的表達(dá)明顯高于si-SNHG1NC 組和空白對(duì)照組（t分別=2.65、5.01，P均＜0.05）。

3 討論

臨床上對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的主要治療方法仍然以手術(shù)為主，放化療為輔的綜合治療方案。至目前為止，替莫唑胺在神經(jīng)外科臨床上已被用作主要輔助藥物對(duì)患者進(jìn)行治療。相關(guān)研究表明，在許多的生物過(guò)程中l(wèi)ncRNA 發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7]，lncRNA雖然是一種非編碼RNA，但能夠以RNA的形式通過(guò)不同的層面在機(jī)體中參與調(diào)控多種生物學(xué)功能，它能夠在表觀遺傳學(xué)、通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的編碼基因，參與干細(xì)胞多功能，體細(xì)胞重編程的調(diào)控等[8,9]，例如lncRNA 都可以通過(guò)參與mRNA剪接、基因組印記和核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物機(jī)制從而來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的分化和細(xì)胞周期的調(diào)控作用[10,11]。機(jī)體內(nèi)生物學(xué)信號(hào)的改變可以對(duì)lncRNA 的水平產(chǎn)生一定影響[12]。Lan 等[13]研究發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌中，lncRNA 的表達(dá)呈現(xiàn)異常，其中某些lncRNA 可以對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的生物學(xué)功能進(jìn)行調(diào)控。Wang 等[14]研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的SNHG1 與腎癌的不良預(yù)后具有一定的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)在肺癌和結(jié)腸癌組織中SNHG1 呈異常表達(dá)，下調(diào)SNHG1 可以對(duì)肺癌細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖起到抑制作用[15,16]。研究顯示在喉鱗狀細(xì)胞癌中敲除SNHG1 可抑制喉癌細(xì)胞的遷移侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。在胃癌[18]、食管癌[19]以及肝癌[20]中SNHG1 均呈現(xiàn)出異常表達(dá)，SNHG1 的水平變化在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重大意義。

本次研究選用人的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、正常腦膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)探索SNHG1 對(duì)替莫唑胺誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞血管生成能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常腦膠質(zhì)細(xì)胞及組織比較，人的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 及組織中SNHG1 的表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。si-SNHG1 組在48 h 和72 h 時(shí)細(xì)胞的增殖能力明顯低于si-SNHG1NC 組和空白對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明高表達(dá)的SNHG1 對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖具有明顯影響，起到抑制細(xì)胞的效果。本次研究對(duì)各組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲情況發(fā)現(xiàn)，si-SNHG1 組細(xì)胞的遷移和侵襲能力較空白對(duì)照組和si-SNHG1NC組明顯下降（P＜0.05）。si-SNHG1 組的小管形成能力明顯高于si-SNHG1NC 組和空白對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明SNHG1 的表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤的血管生成能力方面有著一定的影響。同時(shí)本次研究發(fā)現(xiàn)VEGF 在si-SNHG1 組中的表達(dá)明顯高于si-SNHG1NC 組和空白對(duì)照組（P＜0.05）。以上結(jié)果均提示著SNHG1水平變化在腦膠質(zhì)瘤中具重大作用，SNHG1 可能可以通過(guò)調(diào)控VEGF 的表達(dá)，進(jìn)而來(lái)對(duì)腦膠質(zhì)瘤的血管生成能力產(chǎn)生影響，臨床上把過(guò)表達(dá)的SNHG1來(lái)作為治療腦膠質(zhì)瘤的新型生物標(biāo)志物，同時(shí)在腦膠質(zhì)瘤的基因治療中也可以將其作為潛在的生物靶標(biāo)來(lái)應(yīng)用。目前看來(lái)，本次研究的樣本量太少，規(guī)模不大，有必要在更大樣本的條件下去驗(yàn)證已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更深層次地探討細(xì)胞間的相互作用以及SNHG1參與的分子機(jī)制。

綜上所述，上調(diào)SNHG1 的表達(dá)可以促使替莫唑胺誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、侵襲以及增殖能力下降，從而調(diào)控腦膠質(zhì)瘤的血管生成能力。本研究為腦膠質(zhì)瘤的臨床治療可提供新的方向和思路，但對(duì)于其是否可廣泛應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤的臨床診斷和作為治療干預(yù)靶點(diǎn)，仍然需要大規(guī)模樣本、多中心的臨床研究來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證，促使其以后可能成為腦膠質(zhì)瘤治療的另一突破口。