吳莉萍 高學(xué)仁 王建國

結(jié)直腸癌是一種嚴重威脅人類健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率和死亡率呈增長趨勢[1]。結(jié)直腸癌發(fā)病率存在明顯的地域差異，其中亞非地區(qū)最低[2,3]。我國結(jié)直腸癌發(fā)病率約占全球結(jié)直腸癌發(fā)病的18.6%[2]，其中江蘇、上海等高發(fā)省市的結(jié)直腸癌發(fā)病率已接近甚至超過西方發(fā)達國家[4]?；诮Y(jié)直腸癌發(fā)現(xiàn)晚、侵襲性強、致病機制復(fù)雜等特性[5]，深入研究結(jié)直腸癌診斷標志物及其分子致病機理有重要意義，可為我國結(jié)直腸癌預(yù)防、診斷和治療提供新的思路和方案。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 個核苷酸的非編碼RNA，并在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6，7]。有報道顯示，lncRNAs 的異常表達與結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)[8～12]。PGM5-AS1 是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，已有研究報道該基因在食管癌、非小細胞肺、胃癌等多種腫瘤中表達降低[13]，然而尚未有關(guān)于PGM5-AS1 在結(jié)直腸癌中的表達及具體的生物學(xué)功能研究。因此，本次研究通過對PGM5-AS1組織/細胞表達進行研究，探究其對結(jié)直腸癌細胞增殖和遷移的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 組織標本 結(jié)直腸癌及癌旁組織cDNA標本均由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院高學(xué)仁教授惠贈。本次研究時間為2019年6月至2020年6月。

1.2 結(jié)直腸癌細胞系 人結(jié)直腸癌細胞系NCM460、SW480、HCT116、Lovo 購自于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.3 主要試劑 pCDNA3.1-PGM5-AS1 過表達載體由上海生物工程股份有限公司構(gòu)建。CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒（由上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；胎牛血清（由美國Gibco 公司生產(chǎn)）；DMEM、RPMI1640培養(yǎng)基（由美國Gibco 公司生產(chǎn)）；TRIzol［由生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)］；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 由（Thermo 公司生產(chǎn)）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒5X PrimeScriptTMRT Master Mix（由TaKaRa 公司生產(chǎn)）；Real-time PCR 試劑qPCR SYBR Master Mix（No Rox）（由YEASEN 公司生產(chǎn)）；所有引物均在上海生工科技有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)SW480、HCT116 細胞，含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Lovo細胞，用含10%馬血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)NCM460 并各添加0.1 U/L青霉素和0.1 U/L 鏈霉素置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰酶消化傳代。

1.4.2 細胞轉(zhuǎn)染和分組 當細胞生長狀態(tài)良好，并且細胞密度達到80%～90%時將細胞消化后按每孔5×105個細胞接種至6 孔板中，待細胞生長到70%～80% 融合時，將目的質(zhì)粒（4 μg）稀釋在250 μl無血清RPMI1640中，6 μl Lipofectamine 2000稀釋在250 μl 無血清RPMI1640 中，然后兩者混合，37 ℃孵育20 min 轉(zhuǎn)入細胞中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)6 h 后更換新鮮的10%胎牛血清RPMI1640 完全培養(yǎng)基。體外向HCT116、SW480 細胞轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-PGM5-AS1 過表達載體（過表達組）或空載體pcDNA3.1-N1（空載組），并設(shè)未轉(zhuǎn)染的細胞為對照組。轉(zhuǎn)染48 h 后收集細胞提取總RNA用于后續(xù)熒光定量PCR檢測。

1.4.3 實時熒光定量PCR 取100 mg 組織或1 × 105個培養(yǎng)細胞，采用TRIzol 法提取組織及細胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照PrimeScriptTMRT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，在10 μl 體系中加1 μg 總RNA 進行cDNA 的合成。采用實時定量熒光PCR檢測PGM5-AS1 表達，實時定量熒光PCR 選用2×SYBR Green PCR Mix，取2 μl cDNA 作為模板，引物濃度0.4 μmol/L，10 μl 體系進行擴增，每個待測樣本設(shè)置4個平行樣，根據(jù)目標基因設(shè)計合成相應(yīng)上下游引物進行PCR 擴增，以β-actin 作為內(nèi)參照。引物序列見表1。4次獨立實驗后得到的數(shù)據(jù)運用公式RQ=2-ΔΔct進行分析。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.4.4 CCK-8 將已轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-PGM5-AS1 過表達載體（過表達組），空載體pcDNA3.1-N1（空載組）及未轉(zhuǎn)染的細胞（對照組）培養(yǎng)24 h 后胰酶消化計數(shù)，重懸于完全培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度至20個/μl，以每孔100 μl 加入96 孔板中，每組設(shè)5個復(fù)孔。每孔加入10 μl CCK-8 溶液置于培養(yǎng)箱中孵育2 h 后測量其在450 nm 波長處的吸光度值，連續(xù)測量0 h、24 h、48 h、72 h和96 h吸光度值。

1.4.5 細胞劃痕實驗 細胞轉(zhuǎn)染后消化吹打成細胞懸液，接種于6 孔板過夜，每孔接種密度為5×105個/孔，第2天用100 μl 槍頭垂直6 孔板劃線，磷酸鹽緩沖液沖洗脫落細胞，加入2 ml 無血清RPMI1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，24 h 后倒置顯微鏡下拍照并測量劃痕寬度。實驗重復(fù)3 次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料結(jié)果以均數(shù)±標準差（）表示，圖表通過Graphpad prism 7 繪制，兩組之間比較采用t檢驗。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PGM5-AS1 在結(jié)直腸癌組織及細胞系中的表達見圖1

圖1 PGM5-AS1在結(jié)直腸癌組織及細胞系中的表達

由圖1 a 可見，相比正常癌旁組織，PGM5-AS1在結(jié)直腸癌組織中表達明顯降低（t=11.41，P＜0.05）。由圖1 b 可見，結(jié)直腸癌細胞系（HCT116、SW480、Lovo）較正常結(jié)腸上皮細胞系（NCM460）PGM5-AS1的表達水平明顯降低（t分別=6.76、7.28、9.47，P均＜0.05）。本研究選取PGM5-AS1表達水平相對較低的結(jié)直腸癌細胞系SW480進行后續(xù)實驗。

2.2 構(gòu)建PGM5-AS1 過表達結(jié)直腸癌細胞系 熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示，在HCT116、SW480 細胞中，過表達組的PGM5-AS1 mRNA 相對表達量均高于空載組（t分別=5.72、3.47，P均＜0.05）。HCT116、SW480 細胞的過表達效率分別為（2.72±0.05）%、（3.27±0.06）%。說明構(gòu)建PGM5-AS1過表達模型成功，可用于后續(xù)功能實驗。

2.3 過表達PGM5-AS1 對SW480 細胞增殖的影響見圖2

由圖2可見，轉(zhuǎn)染24 h后，過表達組與對照組吸光度沒有明顯差異（t=0.37，P＞0.05）；與對照組和空載組比較，過表達組轉(zhuǎn)染48 h、72 h、96 h 后的細胞增殖活力降低（t分別=11.72、13.64、7.47、9.67、9.28、7.41，P均＜0.05），對照組和空載組轉(zhuǎn)染48 h、72 h、96 h 后增殖活力比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別=0.65、0.42、0.71，P均＞0.05）。

圖2 過表達PGM5-AS1 對SW480 細胞增殖的影響

2.4 過表達PGM5-AS1 對SW480 細胞遷移的影響見圖3

圖3 過表達PGM5-AS1 對SW480細胞遷移的影響

由圖3 可見，過表達組的劃痕愈合率低于對照組和空載組（t分別=7.73、5.26，P均＜0.05），而對照組和空載組劃痕愈合率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.21，P＞0.05）。

3 討論

外科手術(shù)切除對于早期結(jié)直腸癌患者可以做到根治，對于中晚期患者，術(shù)后輔助應(yīng)用化療及靶向治療等方法在一定程度上改善患者預(yù)后[14]。目前有研究證實lncRNA 在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種癌癥類型中參與癌癥細胞轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等過程，在細胞增殖、凋亡、侵襲中發(fā)揮重要作用，可作為腫瘤早期診斷和預(yù)后的標志物[15，16]。lncRNA PGM5基因被發(fā)現(xiàn)在肺癌、乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌中顯著低表達，lncRNA PGM5 基因表達上調(diào)抑制了細胞增殖和凋亡，表明lncRNA PGM5 基因作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用[17]。PGM5-AS1 是一種由位于人類第9 號染色體蛋白編碼基因PGM5 反義鏈的lncRNA[18]。有文獻報道PGM5-AS1 在前列腺癌中低表達[19]。Zhang 等[20]通過TCGA 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)乳腺癌中，PGM5-AS1 等7 個lncRNAs 出現(xiàn)差異表達。然而關(guān)于PGM5-AS1 在結(jié)直腸癌中的作用機制不明顯。

本次研究前期通過TCGA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)PGM5-AS1在結(jié)直腸癌組織中呈低表達。本次研究采集臨床結(jié)直腸癌組織樣本利用實時定量PCR 技術(shù)檢測PGM5-AS1 的表達，結(jié)果顯示，PGM5-AS1 在結(jié)直腸癌組織中的表達較癌旁組織相比顯著下調(diào)（P均＜0.05）。體外細胞檢測PGM5-AS1 在正常人結(jié)直腸上皮細胞（NCM460）以及不同結(jié)直腸癌細胞（HCT116、SW480、Lovo）的表達情況，結(jié)果顯示，PGM5-AS1 在結(jié)直腸癌細胞株中的表達較正常結(jié)直腸上皮細胞表達顯著下調(diào)。本次研究為進一步探究PGM5-AS1在結(jié)直腸癌中的調(diào)控機制和生物學(xué)功能，選用PGM5-AS1 表達下降最明顯的SW480細胞株作為后續(xù)研究對象，通過構(gòu)建pCDNA3.1-PGM5-AS1過表達載體瞬時轉(zhuǎn)染SW480 和HCT116 細胞株，檢測PGM5-AS1 表達對結(jié)直腸癌細胞增殖和遷移的影響。結(jié)果顯示，PGM5-AS1 表達上調(diào)后，SW480細胞的增殖能力顯著下降，細胞劃痕愈合減弱，即PGM5-AS1 可能通過抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移過程，發(fā)揮其抑癌功效。

綜上所述，結(jié)直腸癌細胞中PGM5-AS1 表達降低并發(fā)揮抑癌基因的作用，上調(diào)PGM5-AS1 水平可抑制腫瘤細胞增殖、遷移能力，這進一步說明了PGM5-AS1 在調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞的生長、組織的惡化和發(fā)展過程中的潛在靶點作用，為結(jié)直腸癌相關(guān)藥物的開展及潛在治療靶點提供理論支持。