陳景，陳建華，劉凱，吳海清,通信作者

磷脂酶D特性及其在功能性磷脂生產(chǎn)中的應(yīng)用

陳景1,2，陳建華1,2，劉凱1,2，吳海清1,2,通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300392；2. 天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300392）

磷脂酶D（Phospholipase D，PLD）是催化磷酸二脂鍵水解和堿基交換反應(yīng)的一類酶的總稱。生產(chǎn)中利用PLD的轉(zhuǎn)酯作用來制備功能性磷脂。本文介紹了磷脂酶的分子結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理及功能，以及磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌醇（PI）的生產(chǎn)方法，包括物理萃取法、化學(xué)合成法和酶促合成法，酶促合成法是目前制備功能性磷脂最主要的方法。此外，對今后功能性磷脂的研究做了展望，期望可以通過改進(jìn)技術(shù)條件、工藝體系來提高PLD的催化性能，為稀有磷脂的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論及相關(guān)技術(shù)支持。

磷脂酶D；特性；功能性磷脂；制備方法；應(yīng)用

磷脂酶D（Phospholipase D，PLD，EC 3.1.4.4）主要作用于脂類物質(zhì)的磷氧鍵，它可催化兩種反應(yīng)：一是水解反應(yīng)，水解磷脂分子中的磷酸二酯鍵生成磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）和羥基化合物；二是轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)（即轉(zhuǎn)酯反應(yīng)），催化磷脂分子末端極性基團(tuán)與另一種含羥基化合物發(fā)生反應(yīng)，生成一種新的磷脂[1]。PLD的轉(zhuǎn)酯作用對磷脂的功能改性尤為重要，其可將含量豐富的磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine，PC）催化合成為其他稀有磷脂，如磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰甘油（Phosphatidylglycerol，PG）、磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，PI）[2]。

磷脂（Phospholiplids，PLs）是生物膜的主要成分，廣泛存在于所有生物中。目前，PLs由于其多用途的營養(yǎng)及生物功能已被廣泛應(yīng)用于食品、制藥和化妝品領(lǐng)域。例如PS被稱為“腦專一性營養(yǎng)物質(zhì)”，具有提高腦細(xì)胞活力、修復(fù)大腦損傷、改善記憶力、平衡情緒以及緩解疲勞等多種生理功能[3-4]，不僅可以預(yù)防和治療老年癡呆癥，而且對治療兒童多動癥、腦萎縮和抑郁癥等也具有顯著效果[5-7]。此外，PG具有良好的脂質(zhì)體形成能力，被廣泛應(yīng)用于藥物緩釋中。PE能有效預(yù)防心臟細(xì)胞損傷以及影響肝胰島素信號傳遞等作用[8]。

雖然PLs可以從蛋黃和大豆中提取，但需要消耗大量的有機(jī)溶劑，導(dǎo)致純化成本高，應(yīng)用領(lǐng)域受限。PLD催化的磷脂?；D(zhuǎn)移反應(yīng)是制備稀有磷脂最主要的工藝方法[9-11]。相比于傳統(tǒng)的物理萃取法和化學(xué)合成法，PLD酶催化法具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)選擇性好、轉(zhuǎn)化率高、純化工藝簡單等優(yōu)點?？梢姡?PLD 酶法合成稀有磷脂可解決功能食品開發(fā)對高品質(zhì)磷脂的迫切需求，推動我國食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

2007年，DE MARIA等對磷脂酶的工業(yè)應(yīng)用進(jìn)行了綜述，主要闡述了其他3種磷脂酶（PLA1、PLA2和PLC）代替PLD在食品工業(yè)中的應(yīng)用[12]。OGINO等對PLs生產(chǎn)中的酶改性和催化工藝進(jìn)行了總結(jié)[13]。但是，關(guān)于PLD的催化性能和改性具體信息還不夠詳盡。另外，2015年以后，有10多種微生物PLD應(yīng)用于PS等功能性PLs的生產(chǎn)中。筆者對微生物PLD的最新研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，重點介紹微生物PLD在特性及功能性磷脂生產(chǎn)中的應(yīng)用。

1 微生物PLD的特性

1.1 PLD的分子結(jié)構(gòu)

PLD的相對分子質(zhì)量為60～120 kDa，多種PLD的一級結(jié)構(gòu)已被測定并報道，LEIROS等[14]首次解析出了鏈霉菌PMF-PLD的三維結(jié)構(gòu)（圖1）。該PLD酶有2個HKD保守序列，包括2個結(jié)構(gòu)域單體，由35個二級結(jié)構(gòu)組成，呈α-β-α-β-α狀排列。每個β鏈包括8～9個β折疊，兩側(cè)含有18個α螺旋。酶整體呈雙葉型，具有偽兩倍對稱軸。組氨酸（His）和賴氨酸（Lys）殘基位于活性位點處，當(dāng)有底物進(jìn)入時直接與其發(fā)生相互作用，天冬氨酸殘基（Asp）則為脫質(zhì)子的組氨酸殘基提供質(zhì)子，不直接與底物發(fā)生相互作用[15]。

1.2 催化機(jī)理

在含有第二底物（親核試劑，如絲氨酸，乙醇胺，甘油等）條件下，PLD能夠催化裂解磷脂磷酸二脂鍵發(fā)生斷裂，并促進(jìn)磷?；c親核試劑結(jié)合，生成新的磷脂。此外，PLD還是特殊的磷脂水解酶，它能夠同時催化磷脂水解，釋放原來磷脂的極性頭部，生成磷脂酸。利用PLD的這一特性，可以通過對自然界中含量高的磷脂酰膽堿為底物，進(jìn)行磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，大量制備所需的高純度稀有磷脂（圖2）[16]。

1.3 PLD反應(yīng)的影響因素

影響PLD反應(yīng)的因素很多，如溫度、pH、金屬離子、有機(jī)溶劑類型等。不同來源的磷脂酶對溫度、pH所產(chǎn)生的影響不同。大多數(shù)PLD最適反應(yīng)溫度在25～40 ℃之間，但也有部分來源的PLD最適溫度在55～65 ℃之間。不同來源的PLD最適pH也不相同。微生物來源的PLD范圍較寬，在4～8之間；植物來源的PLD在酸性范圍，一般在5～6之間。大量研究表明，金屬離子對酶活力有調(diào)節(jié)作用，其中Ca2+是最主要的影響因素。Ca2+不僅能調(diào)節(jié)酶的催化活力，還能調(diào)節(jié)酶對溫度的耐受能力。其他金屬離子也對PLD的活性產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，其作用能力依次為：Ca2+＞Ni7+＞Co2+＞Mg2+＝Mn2+＞N2+（其他二價金屬離子）。此外，PLD反應(yīng)需在雙水相系統(tǒng)中進(jìn)行，表面活性劑（如Triton）的存在有助于底物的溶解，使反應(yīng)更易 進(jìn)行。

2 微生物PLD在功能性PLs生產(chǎn)中的應(yīng)用

2.1 PS的制備

PS是一類普遍存在的磷脂，因具有很高的營養(yǎng)價值和生物活性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域[17-18]。目前PS的制備方法主要有化學(xué)合成法、溶劑萃取法和微生物PLD催化合成法[19-20]。

2.1.1 化學(xué)合成法

雖然PS可以化學(xué)合成，但研究發(fā)現(xiàn)，該方法在商業(yè)生產(chǎn)中存在一些問題。LAMPKINS等[21]以磷脂酰膽堿為原料，合成了酰基為生物素、多肽等磷脂酰膽堿，這些PS的衍生物更容易運送到細(xì)胞內(nèi)并發(fā)揮作用，對人體更加有益。GUANTI等用氯化咪唑催化飽和脂肪酸合成PS，產(chǎn)率可達(dá)74%[22]。但考慮到PS在制備過程中可能受到了污染，且不適合人類使用，因此化學(xué)合成仍不能滿足工業(yè)需求。

2.1.2 溶劑萃取法

PS最初是從動物器官中提?。ㄈ缗ＤX等）出來的，但由于傳染性疾?。ㄈ缗：＞d狀腦?。┑拇嬖谑怪哂幸欢ǖ陌踩[患。目前，主要采用以大豆、蛋黃為原料進(jìn)行提取，但原料利用率及產(chǎn)率較低。同時，由于水產(chǎn)品和乳制品副產(chǎn)品產(chǎn)量較大，一些學(xué)者將其作為新型原料來制備PS[23-24]。然而，溶劑萃取法制備PS有一定的局限性，純化困難，成本高。

2.1.3 PLD介導(dǎo)的酶促法

利用PLD催化PC與L-絲氨酸轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，實現(xiàn)酶法合成PS，成為制備PS的一個新思路。該方法具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)環(huán)境條件適宜、PS產(chǎn)量大等諸多優(yōu)點[25]。國內(nèi)外研究表明，酶反應(yīng)體系條件對PS產(chǎn)量有很大影響。因此，最近的研究進(jìn)展詳細(xì)介紹了PS生產(chǎn)的反應(yīng)體系。

2.1.3.1 單相反應(yīng)體系

單相反應(yīng)體系即反應(yīng)僅在水相中進(jìn)行。CHOOJIT等研究了單水相PLD法生產(chǎn)大豆卵磷脂，在40 min時PS產(chǎn)率為50.9%，在30 h時產(chǎn)率為63.12%[26]。但這種體系由于大量水的存在，導(dǎo)致水解副產(chǎn)物PA大量生成。因此，采用水相生產(chǎn)PS時，一般采用攪拌或添加表面活性劑，使PC在水中處于懸浮狀態(tài)，便于反應(yīng)順利進(jìn)行。

IWASAKI等研究發(fā)現(xiàn)，卵磷脂在硫酸鈣上吸附24 h的PS產(chǎn)率為85.1%，但有11.9%的PA產(chǎn)生[27]。LI等用硅膠60H作為PC的吸附載體，PS和PA產(chǎn)率分別為99.2%和1.2%[28]。后來， ZHANG等利用改性二氧化硅Triton-X-100促進(jìn)了PC在純水溶液中的吸附，PS產(chǎn)率達(dá)到99.0%，PA產(chǎn)率小于1%[29]。即使在改性二氧化硅Triton-X-100連續(xù)操作30次以上時，生產(chǎn)率仍然無損失，是一種潛在的連續(xù)合成PS的方法。

2.1.3.2 兩相反應(yīng)體系

兩相反應(yīng)體系包括有機(jī)相和水相。底物PC和產(chǎn)物PS溶解于非極性有機(jī)相，L-絲氨酸和酶則溶解于水相。傳統(tǒng)體系為水-有機(jī)溶劑兩相體系，在雙相體系中，大多數(shù)PS產(chǎn)率高于50%，從52.1%[30]到94%[31]不等。雖然雙相體系PS產(chǎn)率較高，但酶促反應(yīng)受諸多因素的影響，如有機(jī)溶劑種類、緩沖液類型、兩相體系體積比例、底物濃度比例、pH、溫度等[28，20]。另外，傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑具有一定的毒性，致使酶變性，而且生產(chǎn)的PS不適合人類使用。

2.1.3.3 新型環(huán)保溶劑反應(yīng)體系

水體系不僅浪費底物PC和產(chǎn)品PS，還會產(chǎn)生副產(chǎn)物PA，導(dǎo)致PS純化困難。此外，傳統(tǒng)有機(jī)溶劑如乙醚、乙酸乙酯和氯仿有毒，產(chǎn)品不適合人類使用。因此，迫切需要一種綠色、無毒、非水的酶促體系方法來合成生產(chǎn)PS。迄今為止，科學(xué)家們已經(jīng)研究出了很多新型的環(huán)保溶劑，如離子液體（ILs）[32-33]、深共晶溶劑（DESs）、γ-戊內(nèi)酯、2-甲基四氫呋喃、環(huán)戊基甲醚、檸檬烯和對甲苯等，而且PS產(chǎn)率高于90%，并且沒有副產(chǎn)物PA生成，這樣就大大簡化了后期的分離工序。但由于這些新型環(huán)保溶劑價格較為昂貴，工業(yè)成本較高，難以大規(guī)模應(yīng)用。

2.2 PI的制備

PLD可以水解PC或PE生成PI，PI不僅參與機(jī)體的新陳代謝，還參與真核細(xì)胞的免疫系統(tǒng)。例如，可以預(yù)防大鼠非酒精性脂肪肝[34]，降低小鼠血清和肝臟中的三酰甘油水平[35]，改善人類的膽固醇代謝[36]。

1942年，F(xiàn)LOCH首次從脊髓和腦中發(fā)現(xiàn)肌醇磷脂，但其分離方法十分繁瑣[37]，當(dāng)時未得到認(rèn)可和重視。直到1980年，隨著PI信號途徑及轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制功能不斷被發(fā)現(xiàn)，PI才成為備受研究學(xué)者關(guān)注的熱點。但目前高純度PI的分離純化方法仍然比較繁瑣，適用于實驗室，且產(chǎn)量小，價格昂貴。近年來，國內(nèi)開始研究高純度PI，但由于起步較晚，相關(guān)研究較少，適用于工業(yè)化生產(chǎn)的制備方法尚未出現(xiàn)。鏈霉菌突變菌株是目前為止唯一可以合成PI的微生物。DAMNJANOVIC等獲得了能夠合成PI的兩株突變菌體FRY-PLD和NYR-PLD，突變菌株產(chǎn)生的酶可催化磷脂?；鶊F(tuán)連接在肌醇環(huán)的不同位置，進(jìn)而產(chǎn)生多種PI結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，因此突變體具有較高的PI合成能力，但酶活性和特異性較低[38]。

2.3 PG的制備

PG是一種天然的酸性磷脂，主要存在于植物和微生物中。以往研究表明，PG具有良好的脂質(zhì)體形成能力，廣泛用于緩釋藥物的生產(chǎn)中[39-40]。據(jù)報道，PLD和PC的來源對PG的產(chǎn)量有重要影響。一般來說，鏈霉菌屬來源的PLD酶活性較高，對PG的選擇性也很強(qiáng)。例如，以鏈霉菌PLD為原料，在最佳條件下PG產(chǎn)率接近100%，而色褐鏈霉菌來源的PLD僅產(chǎn)生15%的PG。以大豆PC和蛋黃PC為原料，PG產(chǎn)率分別為71%和68%，而在α-生育酚存在的情況下，鮭魚卵PC生產(chǎn)的PG產(chǎn)率高達(dá)94%。LI等[41]首次報道了PLD經(jīng)過生物印跡固定化后，在8 min內(nèi)PG產(chǎn)率為94%（是游離酶的14倍）。此外，他還發(fā)現(xiàn)，在pH 6.5和45 ℃條件下，將PLD和聚賴氨酸進(jìn)行原位交聯(lián)后，80 min時PG的產(chǎn)率可達(dá)98.6%，重復(fù)13次后仍保持在85.4%以上。因此，構(gòu)建高效、綠色且環(huán)保的純水相體系制備PG，是今后研究的發(fā)展方向。

2.4 PE的制備

PE對心臟有顯著影響，可防止細(xì)胞受損，利于花生四烯酸乙醇胺的合成和肝胰島素信號的傳導(dǎo)[42]。目前，PE主要是從大豆或蛋黃中用溶劑提取，但其純度低，不能滿足工業(yè)需求。近年來，越來越多的學(xué)者致力于研究利用PLD磷酸化合成PE。鄧楊敏等在pH 5.5和28 ℃條件下，利用PLD催化合成PE的產(chǎn)率為87.2%[43]。此外，為了進(jìn)一步滿足工業(yè)需求，人們對PLD的固定進(jìn)行了大量的研究。LI等[28]采用納米級二氧化硅固定PLD，不僅提高了催化活性（是游離PLD的1.5倍），而且PLD的底物親和力、熱穩(wěn)定性以及pH耐受性也得到了很大提高。

2.5 新型結(jié)構(gòu)PLs的制備

除制備PS、PG、PE等天然PLs外，微生物PLD介導(dǎo)的磷酸化也能通過PC合成許多新型結(jié)構(gòu)的PLs。這些新型的PLs由于具有抗氧化和抗癌活性，乳化作用和脂質(zhì)體形成能力較好，因此作為功能性材料而被廣泛應(yīng)用[44]。如糖，苯烷醇，萜烯和乙醇胺衍生物是合成新型PLs的典型受體醇[45]。此外，短鏈脂肪醇由于空間位阻低，也有助于提高PLs的總產(chǎn)量。

3 總結(jié)與展望

磷脂及其衍生物具有多種生物活性和營養(yǎng)功能，未來將會有廣闊的應(yīng)用前景。本文介紹了微生物磷脂酶D（PLD）的分子結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理及功能，通過磷酸化可制備磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇。與其他微生物相比，鏈霉菌屬來源的PLD催化活性更高、底物特異性更廣。此外，文中還介紹了PLs生產(chǎn)中常用的幾種新型環(huán)保溶劑，如離子液體（ILs）、深共晶溶劑（DESs）、γ-戊內(nèi)酯、2-甲基四氫呋喃、環(huán)戊基甲醚、檸檬烯和對甲苯等。今后的研究方向主要是發(fā)現(xiàn)更多高磷酸化活性的新型PLD、確定更多PLD的晶體結(jié)構(gòu)，并通過合理的設(shè)計來提高PLs的產(chǎn)率。

目前，隨著磷脂的需求量越來越大，從大豆和蛋黃中提取磷脂資源有限，不能滿足市場需求，尋找新的提取磷脂原料顯得尤為重要。海產(chǎn)品因其數(shù)量大、種類多、磷脂含量豐富成為未來提取磷脂的良好資源。酶促酯交換法由于反應(yīng)速率快、專一性強(qiáng)、產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高等特性，未來仍是研究方向的重點。相信在研究人員的共同努力下，能夠推動合成功能性磷脂的生產(chǎn)技術(shù)與制備方法的進(jìn)步，未來功能性磷脂將以更高營養(yǎng)與生理作用價值應(yīng)用于各行各業(yè)中，為人類的健康保駕護(hù)航。

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Characteristics of phospholipase D and its application in the production of functional phospholipids

Chen Jing1,2, Zhen Jianhua1,2, Liu Kai, Wu Haiqing1,2,Correspongding Author

（1. College of Food Science and Bioengineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing, Tianjin 300392, China）

Phospholipase D (PLD) is a kind of enzyme which catalyzes the hydrolysis and base exchange of phosphodiesters. Functional phospholipids are prepared by transesterification of PLD. This paper introduced the molecular structure, catalytic mechanism and function of phospholipase. The production methods of phosphatidylserine (PS), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylinositol (PI) were mainly introduced, including physical extraction, chemical synthesis and enzymatic synthesis. Enzymatic synthesis is the most important method to prepare functional phospholipids. In addition, this paper prospected the future research on functional phospholipids. It is expected that the catalytic performance of PLD can be improved by improving the technical conditions and process system, which will provide theoretical and technical support for the industrial production of rare phospholipids.

phospholipase D; characteristic; functional phospholipid; preparation method; application

TQ426.97

A

1008-5394（2021）02-0079-06

10.19640/j.cnki.jtau.2021.02.016

2020-06-15

天津農(nóng)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201810061215）

陳景（1996—），女，本科在讀，研究方向：生物工程。E-mail：2417336926@qq.com。

吳海清（1982—），女，實驗師，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工、發(fā)酵微生物。E-mail：haiqing_w@yeah.net。

責(zé)任編輯：宗淑萍