張秀霞　汪蕾　張澤龍　李軍濤　王冬梅　冼健安

摘要：為探討鎘（Cd）脅迫下凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）血細胞的分子響應，以不同濃度的Cd2+（0，0.5 mg/L和5 mg/L）進行脅迫，于不同脅迫時間取血淋巴，測定血細胞中Trx 2、Grx 2、Grx 3和MGST 3的基因表達量變化。結(jié)果顯示，Trx 2、Grx 3和MGST 3表達量在脅迫的中后期顯著上調(diào)，Grx 2表達量在5 mg/L Cd2+脅迫6 h開始即有顯著的升高，并持續(xù)至48 h。結(jié)果表明在Cd脅迫作用下，對蝦血細胞中上調(diào)這四個氧化還原與抗氧化相關(guān)基因的表達水平，以進行脅迫防御;Grx 2對Cd脅迫較為敏感，在整個脅迫過程發(fā)揮作用，Trx 2、Grx 3和MGST 3主要在脅迫的中后期發(fā)揮作用;基因的表達響應具有一定濃度效應。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）;鎘;血細胞;基因表達

中圖分類號：X503.225

重金屬是造成自然水體環(huán)境破壞的一類主要污染物。鎘（Cd）是其中主要的重金屬元素，對水生動物的毒性極大，且能夠富集在水生動物體內(nèi)，通過食物鏈而毒害人類自身[1]。近年的調(diào)查結(jié)果顯示，海南島近岸海域沉積物中Cd含量較高，存在較高的潛在生態(tài)風險。海南島東部陸架表層沉積物中Cd在個別站位達到了中等潛在生態(tài)危害水平[2]?；▓鰹潮韺映练e物中Cd含量范圍為0.12～0.76 mg/kg，在七種重金屬中潛在生態(tài)風險最高[3]。清瀾港紅樹林濕地沉積物中，包括Cd在內(nèi)的四種重金屬的生物有效態(tài)含量較高，具有較高的釋放風險[4]。陵水新村港近海區(qū)域海水中Cd范圍分別為0～0.58 μg/L，表層沉積物Cd含量為0.175 mg/kg，潛在生態(tài)風險屬于中等水平，危害大小僅次于Hg[5]。

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是海南乃至全國主養(yǎng)的蝦類，水體環(huán)境中的Cd污染對蝦類養(yǎng)殖及人體健康存在較大的風險。前期的研究結(jié)果顯示Cd脅迫會造成蝦類血細胞產(chǎn)生氧化脅迫從而誘導血細胞凋亡[6]，本研究選取四種重要的氧化還原與抗氧化相關(guān)基因，分析這些基因在Cd脅迫過程中的分子響應，初步探討這些基因在應對Cd脅迫的防御機制中的作用，以期為蝦類的健康養(yǎng)殖提供一定的理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗材料

試驗用凡納濱對蝦體重7～10 g，在實驗室環(huán)境條件下（鹽度20‰，pH值7.8～8.0，溫度22～24 ℃，一直保持曝氣并進行循環(huán)過濾）進行馴養(yǎng)，馴養(yǎng)一周后，選取無病患且處于蛻皮間期的對蝦進行脅迫試驗。

1.2鎘脅迫試驗

以CdCl2·2.5H2O作為Cd2+來源，按照《中華人民共和國漁業(yè)水質(zhì)標準》中鎘標準濃度（Cd2+<0.005 mg/L），設(shè)置2個Cd2+脅迫濃度組（0.5 mg/L和5 mg/L），不添加Cd2+作為對照組。試驗在塑料箱中進行，每箱放水40 L，放養(yǎng)對蝦20尾，每組3個平行。試驗期間不投喂，保持曝氣，水體鹽度20‰，pH值 7.8～8.0，水溫22～24 ℃。

1.3總RNA提取

于脅迫的0，6，12，24和48 h進行取樣，每個時間點每組取9尾。用2.5 mL一次性注射器吸取300 μL預冷的抗凝劑（葡萄糖20.5 g/L，檸檬酸鈉8 g/L，氯化鈉4.2 g/L，pH值7.5），從對蝦的腹血竇抽取血淋巴，在800×g、4 ℃條件下離心10 min，棄上清后沉淀即為血細胞，用于總RNA的提取。應用Trizol 法提取血細胞總RNA，取2 μL利用NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Scientific，USA）測定RNA濃度和純度，并以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。

1.4cDNA合成

應用PrimeScriptTM RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa）進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)RNA濃度用DEPC水進行稀釋，在10 μL的反轉(zhuǎn)錄體系中加入500 ng RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板，按照說明書步驟進行操作。cDNA樣本-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5表達定量分析

根據(jù)本研究組克隆的cDNA序列，分別設(shè)計熒光定量PCR引物（表1）。熒光定量PCR實驗使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa），試驗步驟按照說明書進行，每個樣品做3個重復。以β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)目的基因和β-actin的Ct值用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量。

1.6統(tǒng)計分析

結(jié)果顯示為平均值 ± 標準差（Mean ± SD），試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0進行單因素方差分析（One-Way ANVOA），P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果

2.1Cd脅迫對Trx 2基因表達量的影響

Cd脅迫下對蝦血細胞Trx 2表達量變化如圖1所示。當Cd脅迫濃度為0.5 mg/L時，Trx 2表達量在脅迫的24 h和48 h顯著上調(diào)（P<0.05）;在24 h時達到峰值，約為對照組6.0倍。當Cd脅迫濃度為5 mg/L時，Trx 2表達量在脅迫的6 h開始顯著提高（P<0.05）;在24 h時達到峰值，約為對照組9.4倍，顯著高于對照組和0.5 mg/L脅迫組（P<0.05）;在48 h時下降，但仍顯著高于對照組和0.5 mg/L脅迫組（P<0.05）。

2.2Cd脅迫對Grx 2基因表達量的影響

Cd脅迫下對蝦血細胞Grx 2表達量變化如圖2所示。當Cd脅迫濃度為0.5 mg/L時，Grx 2表達量在脅迫的12 h開始顯著上調(diào)（P<0.05）;在24 h時達到峰值，約為對照組3.1倍。當Cd脅迫濃度為5 mg/L時，Grx 2表達量在脅迫的6 h開始顯著提高（P<0.05）;在12 h時達到峰值，約為對照組4.9倍，顯著高于對照組和0.5 mg/L脅迫組（P<0.05）;在24 h和48 h時，0.5 mg/L脅迫組和5 mg/L脅迫組之間沒有顯著差異（P>0.05）。

2.3Cd脅迫對Grx 3基因表達量的影響

Cd脅迫下對蝦血細胞Grx 3表達量變化如圖3所示。當Cd脅迫濃度為0.5 mg/L時，Grx 3表達量在脅迫的48 h顯著上調(diào)（P<0.05），約為對照組的2.5倍。當Cd脅迫濃度為5 mg/L時，Grx 3表達量在脅迫的24 h和48 h有顯著提高（P<0.05），在48 h時達到峰值，約為對照組2.4倍，與0.5 mg/L脅迫組沒有顯著差異（P>0.05）。

2.4Cd脅迫對MGST 3基因表達量的影響

Cd脅迫下對蝦血細胞MGST 3表達量變化如圖4所示。當Cd脅迫濃度為0.5 mg/L時，MGST 3表達量在脅迫的12 h顯著上調(diào)（P<0.05），在24 h有所下降（P>0.05），在48 h再次上升（P<0.05）。當Cd脅迫濃度為5 mg/L時，MGST 3表達量在脅迫的12 h開始有顯著上調(diào)（P<0.05），在24 h時達到峰值，約為對照組4.4倍，并且顯著高于0.5 mg/L脅迫組（P<0.05）。

3討論

以往的研究顯示Cd脅迫對蝦類血細胞產(chǎn)生細胞毒性影響，當Cd達到一定濃度時，可誘導蝦類血細胞ROS的大量產(chǎn)生，造成血細胞的氧化損傷，從而誘導血細胞的凋亡和數(shù)量下降[6-8]。在甲殼動物的鰓、肝胰腺等其它組織中，Cd脅迫也有產(chǎn)生氧化脅迫繼而造成損傷和凋亡的毒性機制。Cd脅迫作用會造成凡納濱對蝦肝胰腺的DNA損傷[7]。河南華溪蟹（Sinopotamon henanense）在Cd脅迫作用下，鰓組織產(chǎn)生大量H2O2，繼而激發(fā)了鰓組織的凋亡過程[9]。在生理生化水平發(fā)現(xiàn)，在Cd脅迫作用下，一些抗氧化酶的活力產(chǎn)生了顯著的響應。Cd脅迫對河南華溪蟹鰓和肝胰腺的超氧化物歧化酶（SOD）同工酶活力具有激活作用，但對過氧化物酶（POD）具有抑制作用[10]。長江華溪蟹（Sinopotamon yangtsekiense）在Cd脅迫下，肝胰腺的SOD、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢[11]。Cd（10 mg/L）脅迫狀態(tài)下克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）肝胰腺和觸角腺中的SOD和CAT活力先被激活后被抑制[12]。這些研究結(jié)果表明在Cd脅迫作用下甲殼動物機體通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)進行抗氧化防御。

本研究針對四個氧化還原與抗氧化相關(guān)基因，研究它們在Cd脅迫作用下的分子響應。Trx和Grx是機體內(nèi)重要氧化還原系統(tǒng)（Trx系統(tǒng)和Grx系統(tǒng)）的核心組成部分，是蛋白質(zhì)的二硫鍵還原酶，在機體蛋白質(zhì)的氧化還原保護過程中起著重要作用[13]。結(jié)果顯示，Trx 2、Grx 2和Grx 3三個基因?qū)d脅迫呈現(xiàn)了不同的表達響應模式。Trx 2的表達量隨著脅迫時間的延長，呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，表明其主要在脅迫后期發(fā)揮作用;Grx 2的表達量在脅迫的6 h即有顯著上調(diào)，后期的表達量基本保持在這一水平，表明Grx 2對Cd脅迫較為敏感，并可能在整個Cd脅迫過程中均發(fā)揮重要保護作用;Grx 3的表達響應較遲緩，在脅迫后期才有顯著上調(diào)，表明Grx 3可能在脅迫后期參與針對Cd脅迫保護作用。從相對表達量峰值來看，Trx 2的最高值可達到對照組的9.4倍，Grx 2和Grx 3分別為對照組的4.9倍和2.4倍，也表明了Trx 2和Grx 2在應對Cd脅迫的防御中發(fā)揮更為重要的作用。Grx 2最為敏感，且響應整個脅迫過程，Trx 2則在脅迫后期有較高的表達響應，Trx 2和Grx 2在應對Cd脅迫的防御中可能存在一定的協(xié)同作用。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）在細胞解毒、內(nèi)外源性脂類新陳代謝、抗氧化等過程中發(fā)揮著極其重要的生物學作用。根據(jù)分布位置不同，GST可分為三類，包括胞質(zhì)GST、線粒體GST和微粒體GST（Microsomal GST，MGST）[14]。本研究分析了MGST 3對Cd脅迫的分子響應，結(jié)果顯示MGST 3的表達響應模式與Trx 2相似，隨著脅迫時間的延長，呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，表明MGST 3主要在Cd脅迫的后期發(fā)揮作用。此外，四個基因?qū)d脅迫的表達響應也存在一定的濃度效應，Cd濃度較高時，基因表達響應更為敏感，且變化程度更為劇烈。

本研究結(jié)果顯示，在Cd脅迫作用下，四個氧化還原與抗氧化相關(guān)基因均呈現(xiàn)了不同程度的表達量上調(diào)，表明凡納濱對蝦血細胞通過上調(diào)這些功能基因的表達水平作出應對Cd脅迫的防御響應。四個基因?qū)d脅迫表現(xiàn)出不同的表達響應模式，在應對Cd脅迫的防御過程中可能存在一定的協(xié)同作用。

參考文獻：

[1] 李玲，吳方舟，梁金榮，等.鎘在蝦蟹中的生物富集和毒性效應的研究進展[J].水產(chǎn)學雜志，2020，33（6）：74-79.

[2] 徐方建，閆慧梅，田旭，等.海南島東部陸架表層沉積物重金屬污染評價[J].中國環(huán)境科學，2016，36（5）：1530-1539.

[3] 陳石泉，蔡澤富，吳鐘解，等.海南花場灣表層沉積物重金屬分布特征及污染評價[J].應用海洋學報，2018（1）：84-93.

[4] 王軍廣，王鵬，伏簫諾，等.海南清瀾港紅樹林濕地沉積物中重金屬形態(tài)及生物有效性[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2019，32（10）：2425-2431.

[5] 鞏慧敏，劉永，肖雅元，等.近海海水和表層沉積物重金屬污染與生態(tài)風險評價——以海南新村港為例[J].農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究，2018，39（4）：700-708.

[6] XIAN J A，LI B，GUO H，et al.Haemocyte apoptosis of the tiger shrimp Penaeus monodon exposed to cadmium[J].Bull Environ Contam Toxicol，2014（92）：525-528.

[7] CHANG M，WANG W N，WANG A L，et al.Effects of cadmium on respiratory burst，intracellular Ca2+ and DNA damage in the white shrimp Litopenaeus vannamei[J].Comp Biochem Physiol C，2009，149（4）：581-586.

[8] 冼健安，王安利，苗玉濤，等.鎘對凡納濱對蝦離體血細胞的毒性影響[J].水生態(tài)學雜志，2012，33（1）：112-115.

[9] WANG J X，WANG Q，LI J R，et al.Cadmium induces hydrogen peroxide production and initiates hydrogen peroxide-dependent apoptosis in the gill of freshwater crab，Sinopotamon henanense[J].Comp Biochem Physiol C，2012，156（3-4）：195-201.

[10] 王蘭，李涌泉，閆博，等.Cd對河南華溪蟹（Sinopotamon henanense）主要組織器官SOD和POD同工酶的影響[J].應用與環(huán)境生物學報，2007，13（6）：823-829.

[11] 閆博，王蘭，李涌泉，等.鎘對長江華溪蟹肝胰腺抗氧化酶活力的影響[J].動物學報，2007，53（6）：1121-1128.

[12] 呼光富，李忠，梁宏偉，等.鎘對克氏原螯蝦肝胰腺觸角腺及鰓中SOD和CAT活性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2009，28（9）：1806-1811.

[13] 黃金昌，郭榮富.谷氧還蛋白和硫氧還蛋白對動物抗氧化應激生物學效應的研究進展[J].動物營養(yǎng)學報，2010，22（4）：845-850.

[14] 鄭佩華，張秀霞，汪蕾，等.凡納濱對蝦微粒體谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶3（MGST3）的基因克隆與功能分析[J].南方農(nóng)業(yè)學報，2020，51（10）：2311-2320.

Effects of cadmium stress on gene expression in hemocytes of the white shrimp Litopenaeus vannamei

ZHANG Xiuxia1，3，WANG Lei2，ZHANG Zelong1，3，

LI Juntao1，3，WANG Dongmei1，3，XIAN Jianan1，3

（1.Hainan Provincial Key Laboratory for Functional Components Research and Utilization of Marine Bio-resources，Institute of Tropical?Biosciences and Biotechnology，CATAS，Haikou 571101，China;2.Institute of Modern Aquaculture Science and Engineering（IMASE），Guangdong?Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture，Guangzhou Key Laboratory of Subtropical Biodiversity and Biomonitoring，Key?Laboratory of Ecology and Environmental Science in Guangdong Higher Education，School of Life Sciences，South China Normal University，Guangzhou，510631，China;3.Hainan Institute of Tropical Agricultural Resources，CATAS，Haikou 571101，China）

Abstract：To investigate the molecular response of haemocytes of the shrimp Litopenaeus vannamei to Cd stress，gene expression levels of Trx 2，Grx 2，Grx 3 and MGST 3 were measured in haemocytes from shrimp exposed to Cd2+ （0，0.5 mg/L and 5 mg/L） for different times.Results showed that the expression levels of Trx 2，Grx 3 and MGST 3 were significantly up-regulated in the middle and late stages of the stress，and the expression level of Grx 2 was significantly increased after 6 h exposure to 5 mg/L Cd2+，and this level continued to 48 h.These results indicate that expression of these four redox and antioxidant related genes in haemocytes of L.vannamei are up-regulated to protect against Cd stress.Grx 2 is sensitive to Cd stress and plays a role in the whole stress process.Trx 2，Grx 3 and MGST 3 mainly play a role in the middle and late stages of the stress.The gene expression response has a certain concentration effect.

Key words：Litopenaeus vannamei; cadmium; hemocyte; antioxidant enzyme; gene expression

（收稿日期：2021-02-24）

基金項目：海南省自然科學基金（319QN306）;中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務費專項資金（1630052019013）。

作者簡介：張秀霞（1982.7-），女，助理研究員，研究方向：水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖。E-mail：zhangxiuxia@itbb.org.cn。

通信作者：冼健安（1983.2-），男，博士，副研究員，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)及毒理學、水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料學。E-mail： xian-ja@163.com。DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2021.03.001