劉葦，鄧朝義，陳興，盧永成，廖德勝

（1. 貴州黔西南喀斯特區(qū)域發(fā)展研究院，貴州 興義 562400；2.普安縣雞洞古茶農(nóng)民專業(yè)合作社，貴州 普安 561500）

大廠茶Camellia tachangensis為山茶科Theaceae山茶屬Camellia茶組Sect.Thea植物[1-7]，是茶組植物中較原始的種之一，在系統(tǒng)進化上處于較原始的位置，對研究茶樹的起源、演化等具有重要價值。大廠茶是特產(chǎn)于滇、黔、桂交界地區(qū)的國家優(yōu)質重點保護茶，也是黔西南州地方特色茶“普安紅”的加工原料。茶葉的品質受茶樹鮮葉中茶多酚類、氨基酸類、生物堿類、茶多糖類、色素類及香氣物質等內(nèi)含物的影響[8-13]。氨基酸是形成茶葉滋味的重要組成部分，對茶湯中鮮、甜滋味有協(xié)調作用[14]。茶葉中的氨基酸分為游離態(tài)氨基酸、結合態(tài)氨基酸，在水浸出物中呈游離狀態(tài)存在的具有α-氨基的有機酸統(tǒng)稱為游離氨基酸（Free amino acid,FAA）[15]，它是茶葉中重要的鮮爽味呈味物質[16]，也是評價茶葉鮮爽度的一個重要指標，在制茶過程中還可轉變?yōu)橄銡馕镔|。茶葉香氣物質即揮發(fā)性芳香物質（Volatile aromatic compounds,VAC）在茶葉中的含量低，但由于其感官閾值低[17]，對茶葉的風味形成和品質都具有重要作用，在各類茶的審評因子中香氣的評分系數(shù)占比達25%～35%[18]。茶葉香氣形成的基本因素和途徑是前體物質的生物合成，而前體物質的含量、種類及酶活性取決于茶鮮葉內(nèi)含物[19-20]。茶葉中的VAC組分主要包括碳氫化合物、醇類、酮類、醛類、酯類、酸類、內(nèi)酯類、含氮和雜氧化合物等[21-23]。

目前，對不同產(chǎn)地、不同種類、不同品種的茶鮮葉及成茶產(chǎn)品的FAA、VAC組分含量、差異比較等研究[24-45]較多也較深入，對大廠茶的主要常規(guī)生化成分（茶多酚、兒茶素、生物堿、氨基酸等）以及大廠茶與山茶屬茶組其他種之間生化成分的差異也有一些研究報道[46-51]，但是對大廠茶的生化成分多樣性、游離氨基酸、香氣等都還鮮有研究報道。本研究通過對黔西南州8株大廠茶野生茶資源的FAA和VAC進行分析，以期為優(yōu)良品系選育和優(yōu)質成茶加工原料篩選提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取貴州省普安縣青山鎮(zhèn)哈馬村和安龍縣海子鎮(zhèn)馬赤黑村的8株野生大廠茶為研究材料，植株均長勢良好，成葉深綠色、革質，芽葉無毛、肥壯、油亮，加工過程中膠質明顯，其具體情況見表1。

表1 8株大廠茶的生物學性狀Table 1 Growth traits of 8 individuals of C.tachangensis

1.2 方法

1.2.1 材料 參照《農(nóng)作物種質資源鑒定技術規(guī)程 茶樹》（NY/T1312—2007）[52]的方法，于2020年5月4日按一芽二三葉的標準采樣，于40℃低溫烘干，待測。

1.2.2 檢測 茶葉中的FAA采用全自動氨基酸分析儀法、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）進行檢測[30,53]，色譜柱為Phenomenex Gemini C18液相色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動相A：25 mmol·L-1醋酸鈉緩沖液:四氫呋喃=95∶5（V∶V），pH 5.8；流動相B：甲醇；熒光檢測：Em340 nm，Ex450 nm；柱溫32℃；流速1 mL·min-1；進樣量5 μL。

茶葉中的VAC采用頂空-固相微萃取-氣質聯(lián)用儀法（HS-SPME-GC-MS）進行測定[20]，在60℃的平板加熱條件下頂空萃取60 min后，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口（溫度250℃）中，熱解析3 min進樣。色譜柱為HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，初始溫度40℃（保留2 min），以3.5℃·min-1升溫至208℃，再以10℃·min-1升溫至308℃，運行時間為55 min；汽化室溫度為250℃。

色譜柱柱溫的計算公式如下：

式中，T1為介于40～208℃的柱溫；T0為初始溫度40℃；t1為柱溫40～208℃時某個芳香物質揮發(fā)出來的保留時間；t0為初始保留時間（2 min）；Z1為40～208℃時的升溫速度3.5℃·min-1；

式中，T2為介于208～308℃的柱溫；T0'為初始溫度208℃；t2為柱溫208～308℃時某個芳香物質揮發(fā)出來的保留時間；t0'為柱溫為208℃時的保留時間；Z2為柱溫為208～308℃時的升溫速度10℃·min-1。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計參數(shù)分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 FAA的結果與分析

2.1.1 大廠茶茶葉中FAA的差異性分析 由表2可知，在8株大廠茶茶葉中的FAA組分除了在Q7的茶葉中檢測到24種（未檢測到色氨酸）、在Q8的茶葉中檢測到23種（未檢測到尿素、色氨酸），在其余6株的茶葉均檢測到25種；25種FAA組分之間含量相差較大。25種FAA組分的含量均值在0.048～3.276 mg·g-1，其中，以茶氨酸的含量最高，為0.671～7.138 mg·g-1，在FAA總量中的占比也最高，為6.228%～37.037%；其次是亮氨酸，其含量為0.777～1.707 mg·g-1，在總量中的占比為7.493%～11.523%；甘氨酸的含量最低，為0.045～0.053 mg·g-1，僅占總量的0.257%～0.468%。在檢測到的7種必需氨基酸（賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸）中，除了亮氨酸的含量均值大于1 mg·g-1，其余6種的含量都小于1 mg·g-1，色氨酸為第一限制氨基酸。

由表2還可以看出，25種FAA組分含量及總量的變異系數(shù)差異也較大（11.513%～64.536%），其中甘氨酸的變異系數(shù)最低（11.513%），色氨酸的變異系數(shù)最高（64.536%）。在8株大廠茶茶葉中，除了6株樣樹之間（Q5、Q6、Q4、Q1、Q7、Q3之間，以及Q4、Q1、Q7、Q3、Q8、Q2之間）的甘氨酸差異不顯著；5株樣樹之間（Q5、Q4、Q8、Q7、Q1之間，Q4、Q8、Q7、Q1、Q3之間，以及Q8、Q7、Q1、Q3、Q2之間）的脯氨酸差異不顯著；5株樣樹之間（Q5、Q3、Q2、Q7、Q6之間）的丙氨酸差異不顯著；5株樣樹之間（Q6、Q4、Q2、Q1、Q3之間）的胱氨酸差異不顯著；5株樣樹之間（Q3、Q1、Q5、Q7、Q6之間）的賴氨酸差異不顯著；4株樣樹之間（Q1、Q2、Q3、Q4之間）的磷乙醇胺差異不顯著，4株樣樹之間（Q5、Q6、Q3、Q4之間）的尿素差異不顯著，前述7種FAA組分在剩余樣樹間的差異，以及其余18種FAA組分和FAA總量在8株大廠茶之間的差異都達到了顯著水平（P＜0.05），說明8株大廠茶樣樹茶葉中的FAA多樣性較豐富。

從表2中可知，在8株大廠茶茶葉中，呈鮮甜味[29,54-55]的FAA組分有天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、茶氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、β丙氨酸、γ氨基丁酸12種，其含量均在5.913～13.529 mg·g-1，在總量中的占比為56.853%～71.872%，其中，呈鮮味[29,54-55]的有天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、茶氨酸4種，其含量在2.194～8.731 mg·g-1，在FAA總量中的占比在20.840%～45.300%；呈苦味[29,54-55]的FAA組分除Q7、Q8有8種（不含色氨酸）外，其余6株都有纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、組氨酸、色氨酸、鳥氨、賴氨酸、精氨酸9種，其含量在3.768～5.754 mg·g-1，在總量中的占比在26.836%～39.661%。以上結果說明，在8株大廠茶茶葉的25種FAA組分中，以呈鮮甜味的組分占絕對優(yōu)勢，這可能是茶湯中鮮爽味及甜味的重要來源。

表2 8株大廠茶茶葉中FAA組分的基本統(tǒng)計參數(shù)Table 2 Component of FAA in 8 individuals of C.tachangensis

2.1.2 不同種類FAA主成分分析 以大廠茶茶葉中25種FAA組分含量為基礎，計算各主成分的因子載荷和貢獻率，結果見表3。由表3可知，前4個主成分（PC1、PC2、PC3、PC4）的貢獻率分別為36.956%、23.889%、16.615%和10.356%，其累積貢獻率為87.825%，所以利用前4個主成分即可代表被考查性狀的原始數(shù)據(jù)信息。其中，PC1的決定因子有13個（尿素、天冬氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、β丙氨酸、γ氨基丁酸、鳥氨酸、賴氨酸），PC2的決定因子有6個（磷乙醇胺、蘇氨酸、茶氨酸、纈氨酸、胱氨酸、色氨酸），PC3的決定因子有3個（谷氨酸、甘氨酸、精氨酸），PC4的決定因子有3個（磷酸絲氨酸、脯氨酸、組氨酸）。而前4個主成分的決定因子總數(shù)為25個，與8株大廠茶樣樹茶葉檢出的FAA組分數(shù)量相等，這說明全部（25種）FAA組分才能反映出大廠茶茶葉FAA的特性。

表3 各FAA組分主成分的因子載荷和貢獻率Table 3 Factor loading and contribution rate of FAA component

2.2 VAC的結果與分析

2.2.1 大廠茶茶葉中VAC的總體情況分析 根據(jù)公式（1）得出，保留時間50 min時色譜柱的柱溫達到208℃；由公式（2）得出保留時間60 min時色譜柱的柱溫達到308℃。從VAC總離子流TIC圖（圖1）可以看出，在8株大廠茶茶葉中的大部分VAC的保留時間在4～45 min，所以對應的色譜柱的柱溫都應按公式（1）計算。出峰時間基本都在4～8、10～15、17～25、27～29、35～36、39～40 min，最大峰值出現(xiàn)在24 min左右?？梢娫?株大廠茶茶葉中，隨著色譜柱柱溫的升高，揮發(fā)出的VAC的量逐漸增多，到117℃左右（保留時間24 min左右）達到最大值，隨后下降，在169.5～173℃（保留時間為39～40 min）時出現(xiàn)最后一次小的峰值后，揮發(fā)出的VAC逐漸趨近0，說明在8株大廠茶茶葉中低沸點（200℃以下）的VAC含量占了絕大部分。

圖1 8株大廠茶茶葉中VAC的總離子流TIC圖Figure 1 Total ion chromatogram of VAC in 8 individual of C.tachangensis

2.2.2 VAC組分分析 由表4可知，從8株大廠茶的茶葉中共鑒定出VAC組分10類104種，其中醇類有28種、醛類有25種、酮類有16種、烷烴類有11種、烯烴類有9種、酯類有6種、酸類有3種、含氮化合物有3種、雜氧化合物有2種、含硫化合物僅1種。在10類化合物中（表5），醇類物質的含量占絕對優(yōu)勢，為52.350%～74.765%，其次是醛類物質，含量為10.425%～26.604%，表明大廠茶茶葉中的VAC是以醇類、醛類為基礎的。

從表5可以看出，在8株大廠茶的茶葉中都含有10類化合物，VAC組分的種類也較豐富，其中以Q5的VAC組分種類最多（94種），其次是Q1和Q2的（88種），Q6的最少（79種），說明8株大廠茶茶葉中的VAC組成存在一定差異。在8個樣株的茶葉中，每類化合物包含的VAC組分種類也存在一定的差異，在Q1中以烷烴類化合物的種類最多（11種），在Q4中以雜氧化合物的種類最多（2種），在Q5中以醇類、醛類、酮類、含氮化合物的種類最多（分別為28、23、14、3種），在Q6中以酯類化合物的種類最多（6種）；在Q4中以醛類化合物的種類最少（20種），在Q6中以醇類、酮類、烷烴類、烯烴類化合物的種類最少（分別為23、9、8、5種），在Q8中以酯類化合物的種類最少（4種）。在每個樣株的茶葉中，VAC組分含量占提取物總量百分比也存在一定的差異，以Q3的VAC組分含量占提取物總量百分比最高（97.348%），Q5的次之（97.242%），Q6的最低（95.794%）。

在8株大廠茶的茶葉中，平均含量大于1%的主要呈香物質[22-23]包括15種（表4），其中醇類有7種、醛類有5種、酮類有2種、酯類僅1種，包括（Z）-3-己烯醇（青葉醇）、芳樟醇及其氧化物、苯乙醇、己醛、（E）-2-己烯醛、苯甲醛、（E,E）-2,4-庚二烯醛、壬醛、（E,E）-3,5-辛二烯-2-酮、反式β-紫羅蘭酮、水楊酸甲酯。8株大廠茶茶葉中的主要呈香物質的平均含量為76.688%，其中以Q5中的含量為最高（79.488%），Q8中的次之（79.284%），Q1中的最低（70.808）。從8株大廠茶茶葉中主要呈香物質的種類看，除Q5只含14種（不含壬醛）外，其余7株均含15種。但從15種主要呈香物質在每個樣株中的貢獻率看，反式β-紫羅蘭酮在Q1、Q5、Q7、Q8中的含量均小于1%，不作為這4株的主要呈香物質；（E,E）-2,4-庚二烯醛在Q2、Q5、Q7、Q8中的含量小于1%，不作為這4株的主要呈香物質；Q5中苯甲醛的含量小于1%、壬醛未檢出，這2個組分也不作為Q5的主要呈香物質。因此，Q3、Q4、Q6的實際主要呈香物質為15種，Q1、Q2的實際主要呈香物質為14種，Q7、Q8的實際主要呈香物質為12種，Q5的實際主要呈香物質僅11種。

表4 8株大廠茶茶葉中揮發(fā)性芳香物質組分及相對含量Table 4 Component and content of VAC in 8 individuals of C.tachangensis

表4（續(xù)）

表4（續(xù)）

表4（續(xù)）

表5 8株大廠茶茶葉中揮發(fā)性芳香物質的組分分類及含量Table 5 Component and content of VAC in 8 individuals of C.tachangensis

根據(jù)香氣特征[56]進行分析（表6），在8株大廠茶茶葉中排名前十位的VAC組分中，除了Q7中第十位的乙酸（有刺激性氣味）含量為1.705%，前九位VAC組分呈花果香、強木香、青草香氣、冬青味及脂肪香味，Q1～Q6、Q8的前十位VAC組分都呈花果香、強木香、青草香氣、冬青味及脂肪香味。在8株大廠茶茶葉中排名前十位VAC組分含量的總和為64.582%～76.107%，在104種VAC組分總含量中占比較大，說明這十個組分可能是大廠茶茶葉表現(xiàn)出花香味、果香味、木香味、青草氣、脂肪香味的重要因素。

表6 8株大廠茶茶葉中居前十位的揮發(fā)性芳香物質組分及其相對含量Table 6 Top ten of VAC components and contents in 8 individuals of C.tachangensis

3 結論與討論

FAA可溶于水，是茶湯滋味的重要組成部分，人體通過飲茶獲得味覺享受的同時也可攝取到多種氨基酸。在茶葉中已發(fā)現(xiàn)的FAA有二十多種，很多本身就是滋味因子，如茶氨酸有類似味精的鮮爽味和焦糖香氣、谷氨酸有甜味和酸味、天冬氨酸有甜味、甘氨酸有獨特的甜味、纈氨酸味微甜而后苦，組氨酸、亮氨酸、酪氨酸具有苦味[29,54-55]。本研究中，在8株大廠茶茶葉中，除了在Q7中檢測到24種FAA組分、在Q8中檢測到23種，在其余6株中均檢測到25種，這25種FAA組分平均含量為0.048～3.276 mg·g-1。茶氨酸作為茶葉中特有的FAA組分，其含量和在FAA總量中的占比都最高，這與前人的研究結果[22-23]相一致，說明茶氨酸是FAA中最重要的組分，也是茶葉鮮爽味的主要組分。檢測到的7種必需氨基酸（賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸）中，色氨酸為第一限制氨基酸。方差分析能有效檢驗均數(shù)差別的顯著性，本研究中，25種FAA組分含量及總量的變異系數(shù)為11.513%～64.536%。多重比較結果顯示，除了7種FAA組分在部分樣樹之間的差異不顯著外，剩余樣樹之間的這7種FAA組分，以及其余18種組分和FAA總量在8株大廠茶之間的差異都較顯著。這些都說明8株大廠茶之間的FAA差異較顯著、多樣性較豐富。

8株大廠茶茶葉的25種FAA組分中，呈鮮甜味[29,54-55]的FAA組分有12種，含量為5.913～13.529 mg·g－1，在FAA總量中的占比為56.853%～71.872%，說明呈鮮甜味的組分在總組分中占絕對優(yōu)勢，這可能是茶湯中鮮爽味及甜味的重要來源。但是由于茶湯滋味是由多種復雜的呈味物質綜合形成，例如澀味受茶多酚類、茶黃素影響，苦味受生物堿類、花青素類、茶皂素影響，鮮爽味受氨基酸、茶黃素、兒茶素、咖啡堿絡合物影響，甜味受氨基酸、可溶性糖類影響，酸味受有機酸、氨基酸影響，咸味受無機鹽影響[22-23]，因此，對大廠茶茶葉滋味的進一步研究還應結合其他內(nèi)含物成分。

如何有效地對種質資源進行評價，是優(yōu)良種質篩選的關鍵，但是在利用多指標進行綜合評判時，其分析結果常常會受到研究者主觀意志的影響。主成分分析能將多個變量組合為幾個新的綜合變量，并找出數(shù)量較少又能盡可能多地反映原始變量信息的綜合變量，從而達到簡化的目的，既能反映原始變量的大部分信息，又能使所含信息不重復，因此廣泛應用于品質綜合評價及品質特征指標篩選中[57-65]。本研究中大廠茶茶葉中25種FAA組分經(jīng)主成分分析可簡化為4個主成分因子(PC1、PC2、PC3、PC4)，前4個主成分的累積貢獻率為 87.825%，絲氨酸等13個組分反映了PC1對FAA的作用，纈氨酸等6個組分反映了PC2對FAA的作用，精氨酸等3個組分反映了PC3對FAA的作用，脯氨酸等3個組分反映了PC4對FAA的作用，因此，可以認為全部（25種）FAA組分才能反映出大廠茶FAA的特性，每種組分在FAA中都有自己的特性和貢獻。

8株大廠茶中VAC的揮發(fā)規(guī)律基本一致，大部分VAC保留時間都在4～45 min，隨著色譜柱柱溫的升高，揮發(fā)出的VAC的量逐漸增多，到117℃左右（保留時間24 min左右）達到最大值，隨后下降，說明在大廠茶茶葉中以低沸點（200℃以下）VAC的含量占了絕大部分。

從8株大廠茶茶葉中共鑒定出VAC組分104種，可分為醇類、醛類、酮類、烴類等10類化合物，以醇類、醛類為基礎。主要呈香物質[22-23]包括15種，其中醇類有7種、醛類有5種、酮類有2種、酯類有1種，平均含量為76.688%，這與SONG[66]揮發(fā)性化合物中只有很少一部分在特征香氣的呈現(xiàn)中起主要作用的觀點一致。在8株大廠茶茶葉中都含有10類化合物，VAC組分種類豐富（為79～94種），但是8個單株的茶葉中每類化合物包含的VAC組分種類以及VAC組分含量占提取物總量百分比都存在一定差異。在8株大廠茶茶葉中，以Q5的主要呈香物質含量最高（79.488%），Q8的次之（79.284%），Q1的最低（70.808%）。從主要呈香物質的種類看，除Q5中只含14種外，其余7株中均含15種。但剔除單株中含量小于1%的主要呈香物質組分后，Q3、Q4、Q6的實際主要呈香物質為15種，Q1、Q2為14種，Q7、Q8為12種，Q5僅為11種，說明15種主要呈香物質對8個樣株茶葉香味的貢獻也存在一定的差異。

根據(jù)香氣特征[56]對8株大廠茶茶葉中排名前十位的VAC組分進行分析，發(fā)現(xiàn)前十位VAC組分含量總和為64.582%～76.107%，在總含量中占比較大，說明這10個組分的香氣特征可能是大廠茶表現(xiàn)出花香味、果香味、木香味、青草氣、脂肪香味的重要因素，在大廠茶成茶加工中形成其獨特的香氣特征方面可加以利用。但是由于茶葉香氣還受其他生化成分、茶葉香氣前體物質[19-20]、加工過程中物質轉化等影響，因此對大廠茶香氣的進一步研究還應結合生物化學、酶學、加工工藝學等進行。

本研究中，對大廠茶茶葉中FAA的組分、含量、特性、呈味特征，VAC的組分種類、含量、主要呈香物質含量和貢獻、香氣特征等的研究結果，為大廠茶的進一步深入研究提供了基礎數(shù)據(jù)，在后期的優(yōu)良單株選育、優(yōu)質原材料篩選及成茶加工中都可進行運用。