陳 琛

(鄭州大學第二附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450014)

胸腔積液是一種臨床常見的并發(fā)癥之一，多見于惡性間皮瘤、肺癌以及間葉源性惡性腫瘤患者[1]，其中以原發(fā)肺腺癌患者居多，細胞形態(tài)學上分為小腺樣、小乳頭狀、透線樣及單細胞形態(tài)等。腺癌細胞的特征在上皮樣間皮瘤中也可見到，兩者鑒別很困難。目前，胸腔積液的病理診斷因缺乏間質(zhì)細胞的增生，且不具備典型的組織形態(tài)結構，導致細胞學檢查很多時候無法準確判定疾病的良惡性及其來源，易導致患者錯過最佳治療時機，從而增加了病死率[2]。細胞蠟塊制備技術可以最大程度保留患者的標本，蠟塊可以連續(xù)切片，結合免疫組化技術多種抗體聯(lián)合運用，陽性顆粒定位在細胞質(zhì)、細胞膜或細胞核，定位清晰，提高了胸腔積液的明確診斷率，還可以明確腫瘤組織來源。本研究旨在探討細胞蠟塊結合免疫組化技術在胸腔積液中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取鄭州大學第二附屬醫(yī)院2018年7月至2020年5月79例送往病理科的臨床高度懷疑惡性的胸腔積液標本，樣本量200～500 mL。其中男31例、女48例，男女比例11.5；年28～83歲齡，中位年齡58歲；單側胸腔積液68例，雙側胸腔積液11例；外觀性狀黃色62例，血性17例。

1.2 常規(guī)細胞學制片方法取50 mL胸腔積液標本置于50 mL試管中，以2 500 r/min的速度離心5 min，棄上清后用吸管吸取底部沉渣的上層白膜層，進行細胞涂片，立即固定在盛有體積分數(shù)95%乙醇的獨立固定液瓶中，固定30 min后進行HE染色。常規(guī)細胞片固定后不用水洗立即進入蘇木素染液5 min，流水沖洗返藍，伊紅染液染1 min，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，濕片封片。

1.3 細胞蠟塊制作方法將臨床送檢的腔腔積液樣本及時放在4 ℃冰箱中靜置，10 h取出液體標本，將上清液輕輕倒去，留取底部沉淀的液體約50～150 mL，將漂浮在液體中的絮狀物用竹簽挑去，混勻后倒入50 mL離心管中，以2 500 r/min的速度離心5 min，富集細胞。用吸管沿著沉淀物的表面輕輕吸取白膜層，加入到已經(jīng)備好的盛有質(zhì)量分數(shù)4%的中性緩沖多聚甲醛離心管中，充分混勻后靜止20 min，以2 500 r/min的速度離心5 min，，棄去上清，加入體積分數(shù)70%乙醇35 mL，振蕩混勻，以2 500 r/min的速度離心5 min，棄去上清，而后加入體積分數(shù)95%乙醇，振蕩混勻，以2 500 r/min的速度離心5 min，常溫靜置約2 h后用吸管輕輕吹打試管底部的沉淀物，將其吹打到與離心管底部分離開來，輕輕倒出已經(jīng)凝集硬化的沉淀物，用濾紙包裹，放入取材盒內(nèi)，蓋上盒蓋，放入德國Leica公司ASP300S脫水機中按程序處理后進行石蠟包埋，細胞蠟塊制作完成。然后進行細胞蠟塊切片，厚度4 μm，70 ℃烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇進水，HE染色，方法與常規(guī)細胞學制片一致。

1.4 免疫組化染色方法采用MaxVision檢測試劑盒，每種抗體均設陽性對照和陰性對照。所選一抗為CEA、TTF-1、Calretinin、CK、CK7、CgA、Syn、CD56、D2-40、WT-1、P40、P63、CK5/6、NapsinA、CDX2、CA199、CA125、PAX-8、ER、PR。試劑均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。細胞蠟塊連續(xù)切片厚度為4 μm，黏附玻片撈片，70 ℃溫箱內(nèi)烤片2 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇過水后置于體積分數(shù)3%的H2O2中，室溫10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。磷酸鹽緩沖液沖洗。放入盛有已經(jīng)沸騰的pH 9.0的乙二胺四乙酸二鈉磷酸鹽緩沖液的金屬鍋中，抗原修復20 min。自來水流水沖洗冷卻，而后蒸餾水洗，磷酸鹽緩沖液沖洗，將組織周圍的水分用紙巾稍擦干后滴加一抗室溫孵育1 h，磷酸鹽緩沖水洗，二抗室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖水洗，二氨基聯(lián)苯胺顯色5 min，顯微鏡下控制顯色的時間，用流水沖去二氨基聯(lián)苯胺顯色液，終止顯色，蘇木素復染30 s，梯度乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。染色結果判斷參考文獻[4]。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0處理相關數(shù)據(jù)，計數(shù)資料用百分數(shù)表示，比較用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 HE染色結果常規(guī)細胞學制片HE染色，因其中的間皮細胞及腫瘤細胞長期浸泡在胸腔積液會導致細胞發(fā)生形態(tài)學改變，如細胞結構模糊不清，細胞膜破裂、細胞核染色模糊等，涂片也會厚薄不均，從而增加臨床診斷難度。細胞蠟塊切片HE染色，細胞量大，細胞結構清晰，細胞核染色質(zhì)均藍色，細胞質(zhì)粉染均勻，紅藍對比良好，染色鮮艷。

2.2 免疫組化染色結果不同病理類型原發(fā)腫瘤細胞免疫組化染色結果不同，腺癌主要表達TTF-1和NapsinA，鱗癌主要表達P40和CK5/6，小細胞癌主要表達CK、Syn、CD56和CgA，惡性間皮瘤及間皮瘤主要表達Calretinin、WT-1、CK5/6和D2-40。不同組織來源的原發(fā)腺癌免疫組化染色結果也不一樣，肺腺癌組織主要表達CK7、NapsinA和TTF-1，胃腸道腺癌組織主要表達CK20、CEA和CDX-2，卵巢癌組織主要表達CA125、PAX-8、ER和PR，乳腺癌組織主要表達ER和PR。

2.3 細胞學制片和細胞蠟塊結合免疫組化技術對惡性胸腔積液的明確診斷率比較細胞蠟塊結合免疫組化技術明確診斷79例(100.00%)，而常規(guī)細胞學制片明確診斷39例(49.37.%)，細胞蠟塊結合免疫組化技術明確診斷率明顯高于常規(guī)細胞學制片，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=53.559，P<0.001)。見表1。

表1 細胞學制片和細胞蠟塊結合免疫組化技術對惡性胸腔積液的陽性檢出率比較

3 討論

臨床上胸腔積液往往借助細胞學制片法進行檢測，其具有操作簡單、敏感性高等優(yōu)點，但大量研究表明，單純該方法的診斷準確率僅約為60%，難以滿足目前臨床上胸腔積液的診斷需求。隨著病理技術的快速發(fā)展，沉渣包埋并結合免疫組化染色在胸腔積液診斷中得到更加廣泛的應用[5]。細胞沉淀在聚集的過程中使其形態(tài)學結構與組織學非常相似，可以清晰展現(xiàn)出其來源組織的結構，如腺癌細胞的腺管樣或乳頭樣排列，對于診斷有極大幫助[3]。同時，蠟塊還可以永久保存，重復切片，并能有效進行免疫組織化學、分子檢測、原位雜交等，同時還可以提取DNA、RNA對疾病進行深入研究。并且細胞蠟塊在細胞學診斷、判斷預后以及靶向藥物治療指導中的應用越來越重要。細胞蠟塊HE染色結合免疫組化技術對胸腔積液中分化程度低、形態(tài)不典型的異型細胞也可以進行準確分型。在本次研究中，常規(guī)細胞學制片36例發(fā)現(xiàn)異型細胞，通過細胞蠟塊結合免疫組化技術可以明確診斷為15例肺腺癌、4例胃腸道腺癌、2例卵巢癌、2例乳腺癌、1例惡性間皮瘤、12例良性間皮細胞增生。常規(guī)細胞學制片診斷的4例未分型惡性腫瘤，通過細胞蠟塊結合免疫組化技術可以明確診斷為1例肺腺癌、1例卵巢癌、1例小細胞癌、1例惡性間皮瘤。因此，與常規(guī)細胞學制片相比，細胞蠟塊結合免疫組化技術對判斷腫瘤的類型以及臨床尋找原發(fā)病灶、對癥治療有重要的指導作用。準確區(qū)分轉(zhuǎn)移癌、間皮增生、間皮瘤等可有助于臨床醫(yī)師選擇精準、有效的治療方式[6]。研究[7]還發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用一組抗體可更有效鑒別漿膜腔積液中腫瘤細胞的來源及分類。本研究僅簡單介紹了臨床常用的免疫組化抗體來輔助診斷腫瘤類型和尋找轉(zhuǎn)移腫瘤原發(fā)病灶，臨床上還可以結合其他不同特異性抗體更好鑒別腺癌細胞和增生的間皮細胞，以進一步提高診斷的準確性[8]。

在處理血性胸腔積液標本時，應盡可能多離心以獲取腫瘤細胞。其次，對紅細胞的處理非常重要。紅細胞過多，切片時標本會脫片，且腫瘤細胞被大量紅細胞包裹會導致結構模糊、不易識別診斷，同時可能會嚴重影響免疫組化結果判讀[9]；深紅色血性胸腔積液的送檢、取材、破紅、細胞蠟塊制作應及時，以免造成蛋白大量沉淀、紅細胞包裹有核細胞、腫瘤細胞退變等[10]。一個優(yōu)質(zhì)的細胞蠟塊應該能夠保存細胞原有的成分、結構，盡量減少蛋白質(zhì)、核酸等大分子的丟失，防止細胞器內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等物質(zhì)被破壞，因此，固定劑的合理應用是保證優(yōu)質(zhì)細胞蠟塊的關鍵。在本次研究中，體積分數(shù)95%乙醇能夠去除蛋白質(zhì)顆粒表面的水化膜，增加蛋白質(zhì)黏度，造成細胞間的聚集，從而對部分大分子蛋白起到沉淀作用，質(zhì)量分數(shù)4%中性緩沖多聚甲醛是最常用的組織細胞固定劑，在組織固定中甲醛的醛基與蛋白質(zhì)的氨基結合形成羥甲基側鏈，這是組織固定反應的基礎，起到對細胞核酸與核蛋白、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間框架穩(wěn)固、保護細胞器普通結構的作用。體積分數(shù)95%乙醇去除蛋白質(zhì)水化膜的原理，對漿膜腔積液沉淀物經(jīng)甲醛固定15 min ，離心棄上清后再加入體積分數(shù)95%乙醇，經(jīng)低速離心使其沉淀物能形成細胞凝塊，這樣保護了細胞蛋白質(zhì)、核酸等成分。這種制備細胞蠟塊的方法簡便、快捷，組織脫水后第2天便能夠與常規(guī)細胞學制片同步進行細胞學診斷，還不影響免疫組化、分子學檢測等后續(xù)工作的開展[11]。

本研究結果還發(fā)現(xiàn)，細胞蠟塊HE染色結合免疫組化技術明確診斷率顯著高于常規(guī)細胞學制片，提示細胞蠟塊結合免疫組化技術是目前臨床上較理想的一種細胞病理診斷方法。另外，臨床獲取胸腔積液制作細胞蠟塊基本屬于無創(chuàng)性操作，獲取標本更容易。

總之，細胞蠟塊結合免疫組化技術可以極大提高胸腔積液的明確診斷率，并可以依靠免疫組化特異指標明確腫瘤組織來源，特別是對留取組織學標本困難的患者意義很大，是一種值得推廣的微創(chuàng)診斷方法。