陳旭青 馬華安 周龍?jiān)? 嚴(yán)道南 劉書(shū)芬 吳繼勇

中圖分類號(hào) R765.2;R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）10-1187-09

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.10.06

摘 要 目的：初步研究黃芪甲苷對(duì)變應(yīng)性鼻炎（AR）模型小鼠改善作用的可能機(jī)制。方法：將C57/BL6小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和黃芪甲苷組，每組10只。除空白組外，其余大鼠均于第0、7、14、21～27天以卵清蛋白為致敏源進(jìn)行攻擊以復(fù)制AR模型。于造模第15～27天，黃芪甲苷組小鼠按0.02 mL/g腹腔注射黃芪甲苷40 mg/kg（第21～27天均于攻擊致敏前1 h給藥），空白組和模型組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次。末次攻擊致敏24 h后，觀察各組小鼠鼻黏膜組織中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，檢測(cè)其鼻腔灌洗液中白細(xì)胞介素4（IL-4）、IL-5、干擾素γ（IFN-γ）含量，鼻黏膜和脾臟組織中活性氧簇（ROS）水平和磷酸化Janus激酶2（p-JAK2）、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6（p-STAT6）陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，以及脾臟組織中JAK2、STAT6蛋白的磷酸化水平（即p-JAK2/JAK2比值、p-STAT6/STAT6比值）。結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠鼻黏膜組織中炎癥細(xì)胞（嗜酸粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞）計(jì)數(shù)，鼻腔灌洗液中IL-4、IL-5含量，鼻黏膜和脾臟組織中ROS水平和p-JAK2、p-STAT6陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，脾臟組織中p-JAK2/JAK2比值、p-STAT6/STAT6比值均顯著升高（P<0.05），鼻腔灌洗液中INF-γ含量顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，黃芪甲苷組小鼠鼻黏膜組織中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)，鼻腔灌洗液中IL-4、IL-5含量，鼻黏膜和脾臟組織中ROS水平和p-JAK2、p-STAT6陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，脾臟組織中p-JAK2/JAK2比值、p-STAT6/STAT6比值均顯著降低（P<0.05），鼻腔灌洗液中INF-γ含量顯著增加（P<0.05）。結(jié)論：黃芪甲苷能夠有效改善AR模型小鼠變應(yīng)性炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與下調(diào)JAK2/STAT6信號(hào)通路及ROS水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞 變應(yīng)性鼻炎;黃芪甲苷;活性氧簇;Janus激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6信號(hào)通路;小鼠

Preliminary Study on the Improvement Effects of Astragaloside Ⅳ on Allergic Rhinitis Model Mice

CHEN Xuqing1，MA Huaan1，ZHOU Longyun2，YAN Daonan1，LIU Shufen3，WU Jiyong1（1. Dept. of Otorhinolaryngology， the Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM， Nanjing 210029， China; 2. Dept. of Rehabilitation， the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210029， China; 3. Faculty of Basic Medicine， Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM， Shanghai 210032， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To preliminarily study the potential mechanism of astragaloside Ⅳ on allergic rhinitis （AR） model mice. METHODS： C57/BL6 mice were randomly divided into blank group， model group and astragaloside Ⅳ group， with 10 mice in each group. Except for blank group， AR model was prepared by sensitization and challenge with ovalbumin on day 0， 7， 14 and 21-27.? Astragaloside Ⅳ group was given astragaloside Ⅳ 40 mg/kg intraperitoneally at the dose of 0.02 mL/g on the 15th to 27th day of modeling （given the drug 1 h before challenge sensitization on the 21st to 27th day）. Blank group and model group were given constant volume of normal saline intraperitoneally， once a day. Twenty-four hours after sensitization from the last challenge， the infiltration of inflammatory cells in the nasal mucosa of each group was observed， and the contents of interleukin 4 （IL-4）， IL-5 and interferon gamma （IFN-γ） in the nasal lavage fluid were measured. The levels of reactive oxygen species （ROS）， and the count of phosphorylated Janus kinase 2 （p-JAK2） and phosphorylation signal transduction and activation of transcription protein 6 （p-STAT6） positive cells in the nasal mucosa and spleen as well as the phosphorylation levels of JAK2 and STAT6 proteins in spleen tissue （i.e. p-JAK2/JAK2 ratio， p-STAT6/STAT6 ratio） were also determined. RESULTS： Compared with blank group， the number of inflammatory cells in the nasal mucosa （eosinophils and mast cells） in the model group， the contents of IL-4 and IL-5 in the nasal lavage fluid， and the levels of ROS in the nasal mucosa and spleen tissues in the model group， the count of p-JAK2 and p-STAT6 positive cells increased significantly， the p-JAK2/JAK2 ratio， p-STAT6/STAT6 ratio in the spleen tissue were significantly increased （P<0.05）， and the content of INF-γ in the nasal lavage fluid was significantly decreased （P<0.05）. Compared with model group， the count of inflammatory cells infiltrated in the nasal mucosa， the contents of IL-4 and IL-5 in the nasal cavity lavage fluid， the level of ROS and the number of p-JAK2 and p-STAT6 positive cellsin the nasal mucosa and spleen tissue as well as the p-JAK2/JAK2 ratio and p-STAT6/STAT6 ratio in spleen tissue were decreased significantly （P<0.05）， and the content of INF-γ in nasal lavage fluid was significantly increased （P<0.05）.? CONCLUSIONS： Astragaloside Ⅳ can effectively improve the inflammatory response in AR model mice， the mechanism of which may be related to down-regulation of JAK2/STAT6 signaling pathway and ROS level.

KEYWORDS? ?Allergic rhinitis; Astragaloside Ⅳ; ROS;JAK2/STAT6 signaling pathway; Mice

變應(yīng)性鼻炎（AR）為耳鼻咽喉頭頸外科最常見(jiàn)的疾病之一[1-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)約有10.0%～40.4%的人口具有AR的臨床表現(xiàn)[4-6]。研究表明，內(nèi)源性活性氧簇（ROS）水平升高以及Janus激酶2（JAK2）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6（STAT6）信號(hào)分子活化是變應(yīng)性炎癥發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制，而選擇性降低ROS水平，抑制JAK2、STAT6信號(hào)分子活化，則能顯著改善AR等變應(yīng)性炎癥[7-10]。黃芪甲苷是AR治療經(jīng)驗(yàn)方——益氣溫陽(yáng)方中君藥黃芪的重要成分[11-13]。研究顯示，該成分能有效改善變應(yīng)性炎癥，但其作用機(jī)制尚不明確[14-15]?；诖?，本研究擬從ROS以及JAK2/STAT6信號(hào)通路角度出發(fā)，初步研究黃芪甲苷對(duì)AR模型小鼠改善作用的可能機(jī)制，旨在為AR的中醫(yī)藥治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括BX51型正置熒光顯微鏡和SZ51型體視顯微鏡（日本Olympus公司）、ChemiDoc XRS型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（美國(guó) Bio-Rad 公司）、CM3050 S型冰凍切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)b10462，純度≥98%）購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司;卵清蛋白（OVA，批號(hào)O1641，純度≥98%）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;ROS檢測(cè)熒光探針-二氫乙啶（DHE）試劑盒（批號(hào)KGAF019）購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;甲苯胺藍(lán)染料（批號(hào)D034-1-1）購(gòu)自南京建成生物工程研究所;蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、TritonX-100試劑、十二烷基硫酸鈉（SDS）、牛血清白蛋白（BSA）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)分別為C0105S、ST795、ST626、ST025、P0018AS、P0012、A0208）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;冰凍切片包埋劑（批號(hào)4583）購(gòu)自美國(guó)Sakura公司;含4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗熒光淬滅封片液（批號(hào)H-1200）購(gòu)自美國(guó)Vector Laboratories公司;聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（批號(hào)IPVH00010）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;白細(xì)胞介素4（IL-4）、IL-5、干擾素γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為70-EK204HS-96、70-EK205HS-96、70-EK280HS-96）均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;兔磷酸化JAK2（p-JAK2）單克隆抗體、兔JAK2單克隆抗體、兔磷酸化STAT6（p-STAT6）多克隆抗體、兔STAT6單克隆抗體、兔β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）兔多克隆抗體（批號(hào)分別為ab32101、ab108596、ab28829、ab32520、ab8227）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;CoraLite 594標(biāo)記的驢抗兔IgG二抗（批號(hào)SA00013-8）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為純化水或超純水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)C57/BL6小鼠30只，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（蘇）2018-0049。所有動(dòng)物按每籠5只飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫為22～24 ℃，相對(duì)濕度為50%～60%，光照時(shí)間為每天12 h;自由攝食飲水，每3天更換1次墊料。本研究實(shí)驗(yàn)方案獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將30只C57/BL6小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、黃芪甲苷組，每組10只。采用基礎(chǔ)致敏聯(lián)合攻擊致敏以復(fù)制AR模型。于造模第0、7、14天進(jìn)行基礎(chǔ)致敏：模型組和黃芪甲苷組小鼠于上述時(shí)間點(diǎn)分別單次腹腔注射OVA-氫氧化鋁混懸液（以O(shè)VA 25 μg、氫氧化鋁1 mg加入至生理鹽水300 μL中，制得）;空白組小鼠于相同時(shí)間點(diǎn)單次腹腔注射同體積生理鹽水。于造模第21～27天連續(xù)進(jìn)行攻擊致敏：模型組和黃芪甲苷組小鼠雙側(cè)鼻腔滴入OVA混懸液（以O(shè)VA 500 μg加入至生理鹽水20 μL中，制得），每側(cè)10 μL，每天1次;空白組小鼠于相同時(shí)間點(diǎn)同法滴入等體積生理鹽水。于造模第15～27天，黃芪甲苷組小鼠腹腔注射黃芪甲苷40 mg/kg（以生理鹽水為溶劑，第21～27天于攻擊致敏前1 h給藥）[15-18]，按0.02 mL/g給藥，每天1次;空白組和模型組小鼠同法注射等體積生理鹽水。若小鼠出現(xiàn)頻繁撓鼻、噴嚏，則視為造模成功[19-20]。AR建模及給藥流程見(jiàn)圖1。

2.2 小鼠樣本的收集與制備

2.2.1 鼻腔灌洗液 于末次OVA鼻腔攻擊致敏24 h后，以戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，并將小鼠固定于超凈工作臺(tái)內(nèi)甲板上，以75%乙醇消毒后剖開(kāi)頸部，分離氣管，于氣管內(nèi)注入生理鹽水1 mL，收集小鼠鼻腔流出的液體，于4 ℃下以1 000×g離心10 min，吸取上清液，分裝保存于-80 ℃冰箱中，備用。

2.2.2 不經(jīng)固定的組織切片 收集鼻腔灌洗液后處死小鼠，每組取3只小鼠，分離其新鮮鼻黏膜及脾臟組織，以冰凍切片包埋劑包埋后切片，制得厚約7 μm的新鮮冰凍組織切片，用于DHE染色;每組另取3只小鼠，分離其新鮮脾臟，經(jīng)錫紙包裹后放入試劑管中，液氮速凍后，移至-80 ℃冰箱中，備用。

2.2.3 經(jīng)固定的組織切片 每組另取4只小鼠，斷頭后將頭部置于4%多聚甲醛溶液中固定1～3天，再置于10%乙二胺四乙酸溶液中脫鈣5天，分離自鼻尖往后10 mm的鼻腔結(jié)構(gòu)組織，樣本依次經(jīng)20%、30%蔗糖溶液脫水后，用冰凍切片包埋劑包埋后切片，制得厚約7 μm的鼻黏膜冰凍組織切片，保存于-80 ℃冰箱中，備用。取剩余脾臟組織置于4%多聚甲醛溶液中固定1～3天，用冰凍切片包埋劑包埋后切片，制得厚度約7 μm的脾臟冰凍組織切片，保存于-80 ℃冰箱中，備用。

2.3 小鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IL-5、INF-γ含量檢測(cè)

取“2.2.1”項(xiàng)下各組6只小鼠的鼻腔灌洗液樣本，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)其鼻腔灌洗液中IL-4、IL-5、INF-γ含量。

2.4 小鼠鼻黏膜組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況觀察

取“2.2.3”項(xiàng)下各組小鼠經(jīng)固定的鼻黏膜冰凍組織切片，經(jīng)HE或甲苯胺藍(lán)染色后封片，于正置顯微鏡下觀察其鼻黏膜組織中炎癥細(xì)胞（嗜酸粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞）的浸潤(rùn)情況并計(jì)數(shù)。

2.5 小鼠鼻黏膜和脾臟組織中p-JAK2、p-STAT6陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)

采用免疫熒光化學(xué)法進(jìn)行檢測(cè)。在室溫下復(fù)溫“2.2.3”項(xiàng)下各組小鼠經(jīng)固定的各組小鼠鼻黏膜和脾臟冰凍組織切片，以pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次;用含0.3%TritonX-100、5%BSA的PBS室溫孵育1 h后，分別滴加以含0.3%TritonX-100、5%BSA的PBS稀釋的兔p-JAK2、p-STAT6抗體（稀釋比例為1 ∶ 200），4 ℃孵育過(guò)夜;以PBS洗滌3次后，滴加以含0.3%TritonX-100、5%BSA的PBS稀釋的CoraLite594標(biāo)記的驢抗兔IgG二抗（稀釋比例為1 ∶ 2 500），室溫避光孵育2 h。以PBS洗滌3次后，滴加含DAPI的抗熒光淬滅封片液，于正置熒光顯微鏡下觀察各組小鼠鼻黏膜和脾臟組織中p-JAK2、p-STAT6的陽(yáng)性細(xì)胞并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 小鼠鼻黏膜和脾臟組織中ROS水平檢測(cè)

取“2.2.2”項(xiàng)下各組小鼠的新鮮鼻黏膜和脾臟冰凍組織切片，以PBS洗滌，加5 μmol/L DHE染液100 μL，于37 ℃孵育30 min;以PBS洗滌后，于正置熒光顯微鏡下觀察其鼻黏膜和脾臟組織中ROS水平。以空白組為參照，以各組與空白組結(jié)果的比值進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 小鼠脾臟組織中p-JAK2、JAK2、p-STAT6、STAT6蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用Western bolt法進(jìn)行測(cè)定。取“2.2.2”項(xiàng)下各組小鼠新鮮脾臟組織，經(jīng)裂解、勻漿、靜置后，以13 000×g離心15 min，獲取上清液。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，于100 ℃下變性5 min。取變性后的蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含5%BSA的TBST溶液室溫封閉2 h后，分別加入以含1%BSA的PBS稀釋的p-JAK2、JAK2、p-STAT6、STAT6、β-actin一抗（稀釋比例均為1 ∶ 2 000），4 ℃孵育過(guò)夜;TBST溶液洗滌3次，加入以含1%BSA的PBS稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1 ∶ 2 000），室溫下孵育1.5 h;以TBST溶液洗滌后，滴加ECL曝光液，于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀下顯影。使用Image J V 1.8.0.112軟件進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參（β-actin）的灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，并以p-JAK2/JAK2比值、p-STAT6/STAT6比值分別表示JAK2、STAT6蛋白的磷酸化水平。以空白組為參照，以各組與空白組結(jié)果的比值進(jìn)行定量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪甲苷對(duì)AR模型小鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IL-5、INF-γ含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IL-5含量均顯著升高，INF-γ含量顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，黃芪甲苷組小鼠鼻腔灌洗液中IL-4、IL-5含量顯著降低，INF-γ含量均顯著升高（P<0.05），詳見(jiàn)表1。

3.2 黃芪甲苷對(duì)AR模型小鼠鼻黏膜組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

空白組小鼠下鼻甲黏膜和鼻底部黏膜組織中均未見(jiàn)明顯的嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠下鼻甲黏膜和鼻底部黏膜組織中均可見(jiàn)大量的嗜酸性粒細(xì)胞，鼻底部黏膜附近可見(jiàn)大量肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞數(shù)量均較空白組顯著增加（P<0.05）。黃芪甲苷組小鼠下鼻甲黏膜和鼻底部黏膜組織中均可見(jiàn)少量嗜酸性粒細(xì)胞，鼻底部黏膜附近可見(jiàn)少量肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞數(shù)量均較模型組顯著減少（P<0.05），詳見(jiàn)圖2（圖中，嗜酸粒細(xì)胞被染成紅色）、圖3（圖中，肥大細(xì)胞被染成紫藍(lán)色，白邊方框?yàn)楹谶叿娇騾^(qū)域的放大圖）、表2。

3.3 黃芪甲苷對(duì)AR模型小鼠鼻黏膜和脾臟組織中p-JAK2、p-STAT6陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

與空白組比較，模型組小鼠鼻黏膜和脾臟組織中p-JAK2、p-STAT6陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著增加（P<0.05）;與模型組比較，黃芪甲苷組小鼠鼻黏膜和脾臟組織中p-JAK2、p-STAT6陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低（P<0.05），詳見(jiàn)圖4～圖7（圖中，紅色熒光表示p-JAK2、p-STAT6蛋白的陽(yáng)性染色，藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核，Merge為二者合并，大白邊方框?yàn)樾“走叿娇騾^(qū)域的放大圖）、表3。

3.4 黃芪甲苷對(duì)AR模型小鼠鼻黏膜和脾臟組織中ROS水平的影響

與空白組比較，模型組小鼠鼻黏膜和脾臟組織中ROS水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，黃芪甲苷組小鼠鼻黏膜和脾臟組織中ROS水平均顯著降低（P<0.05），詳見(jiàn)圖8（圖中，紅色熒光表示ROS陽(yáng)性染色）、表4。

3.5 黃芪甲苷對(duì)AR模型小鼠脾臟組織中p-JAK2/JAK2、p-STAT6/STAT6比值的影響

與空白組比較，模型組小鼠脾臟組織中p-JAK2/JAK2比值、p-STAT6/STAT6比值均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，黃芪甲苷組小鼠脾臟組織中p-JAK2/JAK2比值、p-STAT6/STAT6比值均顯著降低（P<0.05），詳見(jiàn)圖9、表5。

4 討論

黃芪味甘，性微溫，入脾、肺二經(jīng)，以健脾補(bǔ)肺、益氣升陽(yáng)、固表之功見(jiàn)長(zhǎng)，正與AR中醫(yī)“肺脾虛寒”之機(jī)相合，故臨床常用之治療AR一癥[21-22]。黃芪甲苷是中藥黃芪的主要成分[11-13]。研究顯示，該成分對(duì)變應(yīng)性炎癥的抑制具有良好的作用，但其內(nèi)在機(jī)制尚不明確[14-15]?；诖?，本研究擬從ROS以及JAK2/STAT6信號(hào)通路的角度出發(fā)，探討黃芪甲苷對(duì)小鼠AR的潛在效應(yīng)機(jī)制，為AR中醫(yī)藥治療提供一定內(nèi)在依據(jù)。

鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等浸潤(rùn)，以及局部IL-4、IL-5等細(xì)胞因子含量升高，均是AR變應(yīng)性炎癥的病理基礎(chǔ)，亦為評(píng)價(jià)變應(yīng)性炎癥的重要指標(biāo)[23-25]。本研究結(jié)果顯示，OVA誘導(dǎo)的模型組小鼠鼻黏膜組織中可見(jiàn)大量的嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)黃芪甲苷干預(yù)后，小鼠鼻黏膜組織中局部嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少，提示黃芪甲苷對(duì)AR模型小鼠的局部免疫應(yīng)答具有一定的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)ELISA結(jié)果顯示，與模型組小鼠比較，黃芪甲苷組小鼠鼻腔灌洗液中輔助型T細(xì)胞2型（Th2）細(xì)胞因子IL-4、IL-5含量有所下調(diào)，而輔助型T細(xì)胞1型（Th1）細(xì)胞因子INF-γ含量則顯著升高。上述結(jié)果表明，黃芪甲苷對(duì)Th1/Th2細(xì)胞平衡和AR變應(yīng)性炎癥具有較好的改善作用。

JAK2、STAT6廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、膠原合成和免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程，具有介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子分泌的生物學(xué)作用，其活化參與變應(yīng)性炎癥的進(jìn)展，與AR、哮喘、特異性皮炎等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[26-27]。大量研究表明，變應(yīng)性炎癥局部JAK2、STAT6信號(hào)分子磷酸化水平顯著升高，而抑制JAK2、STAT6信號(hào)分子活化則能有效調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，從而改善AR等變應(yīng)性炎癥反應(yīng)[9，26-28]。ROS是JAK2/STAT6信號(hào)通路的上游信號(hào)分子，為AR等變應(yīng)性炎癥發(fā)展過(guò)程中的重要因子[9，29-30]。研究顯示，其水平升高，能調(diào)節(jié)核因子κB、JAK2、STAT6等信號(hào)分子，誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞活化以及B細(xì)胞釋放IgE，從而促進(jìn)變應(yīng)性炎癥的進(jìn)展[7，10，31-33]。更有研究表明，選擇性降低ROS水平能顯著降低JAK2、STAT6等信號(hào)分子活性，進(jìn)而改善AR等變應(yīng)性炎癥反應(yīng)[10，29，34]。本研究結(jié)果顯示，AR模型小鼠鼻黏膜和脾臟組織中p-JAK2、p-STAT6陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)和ROS水平均顯著升高，脾臟組織中p-JAK2/JAK2、p-STAT6/STAT6比值均顯著升高;經(jīng)黃芪甲苷干預(yù)后，小鼠鼻黏膜和脾臟組織中JAK2、STAT6陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和ROS水平以及脾臟組織中p-JAK2/JAK2、p-STAT6/STAT6比值均較模型組顯著降低?；谏鲜鼋Y(jié)果，筆者認(rèn)為黃芪甲苷有效抑制AR變應(yīng)性炎癥的效應(yīng)可能與下調(diào)ROS水平及抑制JAK2/STAT6信號(hào)通路相關(guān)。

但本研究存在一些不足：（1）本次研究主要涉及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)將開(kāi)展體外實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步明確藥物結(jié)合的蛋白及靶點(diǎn);（2）鑒于鼻黏膜樣本量較少，本研究雖提取了相關(guān)樣本，但未能對(duì)全部樣本開(kāi)展有效的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、Western blot檢測(cè)分析;（3）由于涉及ROS、JAK2/STAT6信號(hào)通路機(jī)制的常規(guī)陽(yáng)性藥物缺乏，故未設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，本課題組下一步將篩選具有對(duì)比意義的陽(yáng)性藥物，開(kāi)展更全面、深層次的研究，為黃芪甲苷治療AR提供更豐富的臨床前證據(jù)。

綜上，中藥黃芪有效成分黃芪甲苷能夠有效改善AR模型小鼠的變應(yīng)性炎癥反應(yīng)，其內(nèi)在機(jī)制可能與調(diào)控JAK2/STAT6信號(hào)通路及ROS水平相關(guān)，即下調(diào)JAK2/STAT6信號(hào)通路及ROS水平可能是AR精準(zhǔn)治療的潛在靶點(diǎn)之一。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] KLIMEK L，SPERL A，BECKER S，et al. Current therapeutical strategies for allergic rhinitis[J]. Expert Opin Pharmacother，2019，20（1）：83-89.

[ 2 ] BOUSQUET J，KHALTAEV N，CRUZ A A，et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma（ARIA）2008 update[J].Allergy，2008，63（Suppl 86）：8-160.

[ 3 ] 白尚杰，梁莎，魯曉軍.玉屏風(fēng)顆粒對(duì)變應(yīng)性鼻炎合并支氣管哮喘患兒免疫功能及相關(guān)指標(biāo)的影響[J].中國(guó)藥房，2018，29（4）：530-533.

[ 4 ] CHONG S N，CHEW F T. Epidemiology of allergic rhinitis and associated risk factors in Asia[J]. World Allergy Organ J，2018，11（1）：17.

[ 5 ] BOZEK A，SCIERSKI W，IGNASIAK B，et al. The prevalence and characteristics of local allergic rhinitis in Poland

[J]. Rhinology，2019，57（3）：213-218.

[ 6 ] WANG X Y，MA T T，WANG X Y，et al. Prevalence of pollen-induced allergic rhinitis with high pollen exposure in grasslands of northern China[J]. Allergy，2018，73（6）：1232-1243.

[ 7 ] SHI Q，LEI Z，CHENG G，et al. Mitochondrial ROS activate interleukin-1β expression in allergic rhinitis[J]. Oncol Lett，2018，16（3）：3193-3200.

[ 8 ] SEBAG S C，KOVAL O M，PASCHKE J D，et al. Mitochondrial CaMKⅡ inhibition in airway epithelium protects against allergic asthma[J]. JCI Insight，2017，2（3）：e88297.

[ 9 ] DING F，LIU B，ZOU W，et al. LPS exposure in early life protects against mucus hypersecretion in ovalbumin-induced asthma by down-regulation of the IL-13 and JAK-STAT6 pathways[J]. Cell Physiol Biochem，2018，46（3）：1263-1274.

[10] NAGARAJ C，HAITCHI H M，HEINEMANN A，et al. Increased expression of p22phox mediates airway hyperresponsiveness in an experimental model of asthma[J]. Antioxid Redox Sign，2017，27（18）：1460-1472.

[11] 嚴(yán)道南，馬華安，郭小紅，等.益氣溫陽(yáng)方對(duì)變應(yīng)性鼻炎肺脾虛寒證的臨床療效[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27（1）：19-21.

[12] 王曼，嚴(yán)道南，陳旭青，等.益氣溫陽(yáng)湯聯(lián)合舌下免疫治療中重度持續(xù)性變應(yīng)性鼻炎的療效分析[J].遼寧中醫(yī)雜志，2017，44（6）：1190-1193.

[13] 陳旭青，馬群，周龍?jiān)?，?益氣溫陽(yáng)方對(duì)變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻黏膜NK細(xì)胞浸潤(rùn)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2017，52（12）：921-926.

[14] JIN H，WANG L，LI B，et al. Astragaloside Ⅳ ameliorates airway inflammation in an established murine model of asthma by inhibiting the mTORC1 signaling pathway[J].Evid Based Complement Alternat Med，2017，2017：4037086.

[15] HUANG X，TANG L，WANG F，et al. Astragaloside Ⅳ attenuates allergic inflammation by regulation Th1/Th2 cytokine and enhancement CD4+CD25+ Foxp3 T cells in oval- bumin-induced asthma[J]. Immunobiology，2014，219（7）：565-571.

[16] DU Q，CHEN Z，ZHOU L，et al. Inhibitory effects of astra- galoside Ⅳ on ovalbumin-induced chronic experimental asthma[J]. Can J Physiol Pharm，2008，86（7）：449-457.

[17] LI K，CHEN Y，JIANG R，et al. Protective effects of astra- galoside Ⅳ against ovalbumin-induced allergic rhinitis are mediated by T-box protein expressed in T cells/GATA-3 and forkhead box protein 3/retinoic acid-related orphan nuclear receptor γt[J]. Mol Med Rep，2017，16（2）：1207-1215.

[18] HEMMATI S，RAHIMI N，DABIRI S，et al. Inhibition of ovalbumin-induced allergic rhinitis by sumatriptan through the nitric oxide pathway in mice[J]. Life Sci，2019，236：116901.

[19] 苗明三，項(xiàng)麗玲，苗艷艷.變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型制備規(guī)范：草案[J].中草藥，2018，49（1）：50-57.

[20] 欒兆磊，王雨農(nóng)，王洪田.變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2016，30（13）：1090- 1094.

[21] 許江濤，張麗娟，霍宇航，等.黃芪多糖對(duì)肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎大鼠TSLP、OX40L mRNA表達(dá)的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，37（9）：1747-1752.

[22] 胡思茂.黃芪桂枝五物湯合蒼耳子散治療過(guò)敏性鼻炎臨床療效及對(duì)免疫功能的影響[D].福州：福建中醫(yī)藥大學(xué)，2018.

[23] EIFAN A O，DURHAM S R. Pathogenesis of rhinitis[J].Clin Exp Allergy，2016，46（9）：1139-1151.

[24] KIM E H，KIM J H，SAMIVEL R，et al. Intralymphatic treatment of flagellin-ovalbumin mixture reduced allergic inflammation in murine model of allergic rhinitis[J]. Allergy，2016，71（5）：629-639.

[25] BUI T T，PIAO C H，HYEON E，et al. Preventive effect of bupleurum chinense on nasal inflammation via suppressing T helper type 2，eosinophil and mast cell activation[J]. Am J Chin Med，2019，47（2）：405-421.

[26] ALMEIDA-OLIVEIRA A R，AQUINO-JUNIOR J，ABBASI A，et al. Effects of aerobic exercise on molecular aspects of asthma：involvement of SOCS-JAK-STAT[J].? ?Exerc Immunol Rev，2019，25：50-62.

[27] WANG J，SHEN Y，LI C，et al. IL-37 attenuates allergic process via STAT6/STAT3 pathways in murine allergic rhinitis[J]. Int Immunopharmacol，2019，69：27-33.

[28] WANG T，CHEN D，WANG P，et al. MiR-375 prevents nasal mucosa cells from apoptosis and ameliorates allergic rhinitis via inhibiting JAK2/STAT3 pathway[J]. Biomed Pharmacother，2018，103：621-627.

[29] XU Z，WU H，ZHANG H，et al. Interleukins 6/8 and cyclooxygenase-2 release and expressions are regulated by oxidative stress-JAK2/STAT3 signaling pathway in human bronchial epithelial cells exposed to particulate matter ≤2.5 μm[J]. J Appl Toxicol，2020，40（9）：1210-1218.

[30] KWON B I，KIM T W，SHIN K，et al. Enhanced Th2 cell differentiation and function in the absence of Nox2[J]. Allergy，2017，72（2）：252-265.

[31] KIM H J，LIM J，JANG Y，et al. Exogenous hydrogen pe- roxide induces lipid raft-mediated STAT-6 activation in T cells[J]. Cell Physiol Biochem，2017，42（6）：2467-2480.

[32] GILLJAM K M，HOLM K L，ZAHOOR M，et al. Dif-? ? ferential effects of reactive oxygen species on IgG versus IgM levels in TLR-stimulated B cells[J]. J Immunol，2020，204（8）：2133-2142.

[33] RAMIREZ-MORENO I G，IBARRA-SANCHEZ A，CASTILLO-ARELLANO J I，et al. Mast cells localize in hypoxic zones of tumors and secrete CCL-2 under hypoxia through activation of L-type calcium channels[J]. J Immunol，2020，204（4）：1056-1068.

[34] YU S，ZHAO C，CHE N，et al. Hydrogen-rich saline at- tenuates eosinophil activation in a guinea pig model of? ? allergic rhinitis via reducing oxidative stress[J]. J Inflamm，2017，14（1）：1.

（收稿日期：2020-12-26 修回日期：2021-03-25）

（編輯：鄒麗娟）