王帥，趙海濤，閆艷華，劉會(huì)會(huì)，王雅靜，張亮，王磊

(1.唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北 唐山063000；2.河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)新中心，河北唐山063000；3.唐山市功能性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北唐山063000）

0 引 言

隨著全球范圍內(nèi)乳及乳制品的需求量增大，世界各國(guó)對(duì)生牛乳中農(nóng)藥殘留檢測(cè)越來(lái)越重視[1-4]。生牛乳中的農(nóng)藥殘留主要來(lái)源喂食奶牛的飼料，其所含農(nóng)藥種類(lèi)范圍較廣，殘留量相對(duì)較高，但現(xiàn)有的方法難以同時(shí)分析生牛乳基質(zhì)中不同類(lèi)型的農(nóng)藥殘留[5-10]。

目前，按照GB/T 5009.162—2008《動(dòng)物性食品中有機(jī)氯農(nóng)藥和擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥多組分殘留量的測(cè)定》的規(guī)定對(duì)生牛乳進(jìn)行檢測(cè)[11]。通過(guò)實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，國(guó)標(biāo)方法操作繁瑣、有機(jī)試劑耗費(fèi)量?jī)艋怀浞?，?dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的不確定性增加。田宏哲等[12]采用乙腈、Oasis HLB提取凈化后，利用HPLC-MS/MS測(cè)定牛奶中6種氨基甲酸脂類(lèi)農(nóng)藥；陳美瑜等[13]利用GC-MS/MS結(jié)合基質(zhì)固相分散前處理對(duì)牛奶中32種農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)；劉毅等[14]建立了牛奶中20種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的GC-MS/MS檢測(cè)方法；可以看出，國(guó)內(nèi)的研究主要還停留在對(duì)單一類(lèi)農(nóng)藥的檢測(cè)[15-16]。因此，建立一種凈化效果好、準(zhǔn)確度高，可滿(mǎn)足同時(shí)測(cè)定生牛乳中多類(lèi)農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法，具有重要意義。

本研究采用自動(dòng)QuEChERS-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立生牛乳中112種農(nóng)藥殘留的高通量檢測(cè)方法，涉及農(nóng)藥種類(lèi)全，涵蓋了殺蟲(chóng)劑類(lèi)、殺菌劑類(lèi)、除草劑類(lèi)等農(nóng)藥。前處理方法有效的減少試劑用量，解放勞動(dòng)力，縮短前處理時(shí)間，可滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)外對(duì)生牛乳中農(nóng)藥殘留的測(cè)定需求。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

LCMS-8040液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源（ESI），日本島津公司；SiO-6512全自動(dòng)前處理設(shè)備，本立科技公司；SZ 13022-NY0.2μm有機(jī)濾膜，天津市領(lǐng)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備股份有限公司；T-200電子天平，常熟雙杰儀器制造廠。

1.1.2 試劑與材料

標(biāo)準(zhǔn)品氧樂(lè)果、二甲戊靈、氟蟲(chóng)腈等112種均購(gòu)于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；提取劑內(nèi)含5.5 g無(wú)水硫酸鎂、1.5 g氯化鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉及1 g檸檬酸鈉，凈化劑內(nèi)含4 mm氧化鋯珠5粒、100 mgN-丙基乙二胺（PSA）、600 mg無(wú)水硫酸鎂及100 mgC18，氧化鋯珠（R 104）和雙層提取凈化管（V50），均購(gòu)于本立科技公司；乙腈為色譜純；0.05%甲酸溶液；5 mmol/L甲酸銨溶液；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水（屈臣氏）；生牛乳樣品，購(gòu)買(mǎi)于唐山市市場(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別吸取濃度為1 000μg/m L的單個(gè)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)100μL，用乙腈定容至10 mL，得到濃度為10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

農(nóng)藥基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：取樣品空白溶液分別配制0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.2μg/mL的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 精密度測(cè)定方法

取空白生牛乳樣品，添加農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度0.02、0.12、0.2 mg/kg，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，根據(jù)精密度公式可計(jì)算樣品精密度。

式中：RSD為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；s為標(biāo)準(zhǔn)偏差；x為算數(shù)平均值；xi為樣品測(cè)定值；n為樣品重復(fù)測(cè)定次數(shù)。

1.2.4 回收率測(cè)定方法

式中：C0為回收濃度；C1為樣品添加濃度。

1.2.5 樣品前處理

稱(chēng)取5.0 g生牛乳樣品于離心管外管中，加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（外標(biāo)法），靜置30 min，加入10 mL乙腈及10 mL水，加入萃取鹽包（內(nèi)含5.5 g無(wú)水硫酸鎂，1.5 g氯化鈉，0.5 g檸檬酸氫二鈉，1.0 g檸檬酸鈉）及10顆鋯珠，擰緊內(nèi)管（內(nèi)含4 mm氧化鋯珠5粒，100 mg PSA，600 mg無(wú)水硫酸鎂，100 mg C18）后放入自動(dòng)QuEChERS前處理儀器中開(kāi)始處理，經(jīng)25 min交替震蕩離心后，從內(nèi)管中取凈化液過(guò)0.22μm的有機(jī)微孔濾膜，濾液供LC-MS/MS測(cè)定。同時(shí)取空白生牛乳樣品，按照上述前處理操作制備樣品空白提取液，用于配制基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

在空白樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，添加濃度為0.02、0.12、0.2 mg/kg，每個(gè)添加水平重復(fù)6次。

1.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：Phenomenex H 18（50 mm×3.00 mm，2.60μm）；柱溫：40℃；流速：0.40 mL/min；進(jìn)樣量：2μL；流動(dòng)相：A相5 mmol/L甲酸銨+0.05%甲酸水溶液、B相純甲醇；洗脫程序：0.5～5.0 min，10%B；5.0～8.0 min，95%B；8.0～10 min，10%B。

電噴霧離子源（ESI）；霧化氣流量3.00 L/min；干燥氣流量15.00 L/min；DL管溫度為250℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析

根據(jù)國(guó)內(nèi)外乳及乳制品主要農(nóng)藥殘留的種類(lèi)，本研究一共對(duì)115種農(nóng)藥進(jìn)行了選擇。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)水胺硫磷、殺螟硫磷、異菌脲未出現(xiàn)響應(yīng)；根據(jù)本試驗(yàn)所確定的分析條件，將質(zhì)量濃度均為0.4μg/mL的112種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以保留時(shí)間定性，HPLC-M S/MS總離子流圖見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，112種化合物能在10.0 min內(nèi)峰型尖銳，對(duì)稱(chēng)性好，出峰附近都沒(méi)干擾峰，是理想的色譜檢測(cè)條件。

圖1 112種農(nóng)藥總離子流圖

2.2 線性關(guān)系、回收率和精密度

通過(guò)回收率、線性、精密度對(duì)自動(dòng)QuEChERS結(jié)合LC-MS/MS方法進(jìn)行驗(yàn)證。利用生牛乳空白基質(zhì)配制濃度為0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.2μg/mL的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；取空白生牛乳樣品，添加農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為0.02、0.12、0.2 mg/kg，每個(gè)濃度重復(fù)6次。根據(jù)樣品回收率計(jì)算公式，進(jìn)而得出平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。本研究以待測(cè)農(nóng)藥回收率在70%~120%、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%時(shí)的最小添加濃度為定量限。112種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)，回收率及精密度結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 112種農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回收率及精密度

由上述結(jié)果可以看出，幾乎所有待測(cè)農(nóng)藥在生牛乳中線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.9990~0.9999范圍內(nèi)，得到的回收率均在80.24%~117.67%之間，RSD值為0.27%~14.92%，在對(duì)生牛乳112種農(nóng)藥檢測(cè)結(jié)果中，農(nóng)藥的定量限為0.01mg/kg，符合痕量分析的要求。進(jìn)一步表明自動(dòng)QuEChERS方法結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)生牛乳中農(nóng)藥殘留檢測(cè)具有可行性和通用性。

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

本方法具有快速、簡(jiǎn)便、可操作強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于生牛乳中不同種類(lèi)農(nóng)藥同時(shí)檢測(cè)的需求。2020年內(nèi)從市場(chǎng)采集生牛乳樣品260份，采用自動(dòng)QuEChERS方法結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)樣品進(jìn)行了分析檢測(cè)，其中均未有農(nóng)藥檢出，同時(shí)取空白樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，RSD值均＜15%，回收率均在70%~120%之間。結(jié)果表明，本方法能夠滿(mǎn)足大規(guī)模生牛乳中農(nóng)藥的篩查和定量分析。

3 結(jié) 論

本研究建立了自動(dòng)QuEChERS結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定生牛乳中112種農(nóng)藥殘留的方法。農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.005~0.2μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)（r）在0.9973~0.9999范圍內(nèi)；在0.02、0.12、0.2 mg/kg的添加濃度下的回收率為80.24%~117.67%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD=6）為0.27%~14.92%，方法定量限為0.01 mg/kg。該方法保證了定性及定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，為生牛乳中農(nóng)藥檢測(cè)提供了技術(shù)支撐。方法經(jīng)多次驗(yàn)證，精密度、準(zhǔn)確度高，線性關(guān)系好，能夠滿(mǎn)足國(guó)家對(duì)生牛乳中的農(nóng)藥進(jìn)行大規(guī)模的篩查和定量分析。