王一冉

（山東藥品食品職業(yè)學(xué)院，山東威海264210）

0 引 言

氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides，AGs)是一類廣譜抗生素，化學(xué)結(jié)構(gòu)上包含兩個以上氨基糖并由配苷鍵與中心的己糖或戊糖相連[1-2]，是畜牧養(yǎng)殖中的常用藥物[3-4]。由于AGs會對人體有損傷，乳制品為國民日常消費品，加強(qiáng)了AGs在動物源性食品中殘留的監(jiān)控也十分必要。

大多數(shù)AGs化合物化學(xué)性質(zhì)為弱堿性[5-7]，在加之樣品基質(zhì)為高蛋白和高脂肪含量的乳制品，一般前處理方式下化合物的回收率不理想[8-10]。一般采用的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)對樣品前處理有嚴(yán)苛要求，同時測定時流動相中要加入離子對試劑，這也會導(dǎo)致目標(biāo)化合物回收率較低的問題[11-13]。親水交互作用色譜（Hydrophilic interaction chromatgraphy，HILIC）是一種介于正相色譜與反相色譜之間的一種技術(shù)[14-16]，用于分離強(qiáng)極性的化合物，易與質(zhì)譜聯(lián)用，可解決多種AGs的分離問題。同時前處理采用基質(zhì)固相分散(Matrix solid phase dispersion，MSPD)技術(shù)可有效分離提取復(fù)雜基質(zhì)中強(qiáng)極性的AGs組分，提高了方法的實用性[17-18]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Agilent 1200-API 4000高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,ABSciex公司；Obelisc R色譜柱（2.1mm×100mm，5μm），飛諾美公司；ZIC-HILIC色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm），沃特世公司；BEH-HILIC色譜柱（2.1mm×100mm，3μm），島津有限公司。

大觀霉素（99.0%）、鏈霉素（98.0%）、雙氫鏈霉素（99.0%）、阿米卡星（98.0%）、卡那霉星（97.5%），標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；樣品來源隨機(jī)購買于超市的乳制品。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

稱取0.5 g樣品，加入二氧化硅和EDTA二鈉鹽填料混勻填入到SPE小柱中?？刂?.0 mL/min速度淋洗小柱后，用2 mL 0.1%甲酸溶液洗脫后收集洗脫液，并定容至2.0 mL，過0.22μm濾膜后分析。

1.2.2 色譜條件的優(yōu)化

用于親水交互作用色譜的固定相為極性，易吸附樣品溶液中的極性分子，從而促進(jìn)目標(biāo)物從流動相中分配至固定相表面上的極性液層。參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-18]，本試驗考察烷基三甲銨乙酯的HILIC色譜柱(ZIC-HILIC)、結(jié)合離子交換作用的HILIC色譜柱(Obelisc R)和鍵合相為硅膠的HILIC色譜柱(BEH-HILIC)3種色譜柱，并對流動相溶液進(jìn)行了比較分析。

1.2.3 MSPD條件的優(yōu)化

實驗針對洗脫液分別考察了水、0.1%甲酸以及乙腈等溶液[19-20]，以樣品的加標(biāo)回收率考察提取效果。

1.2.4 儀器條件

色譜條件：Obelisc R柱(2.1 mm×100 mm,5μm)；進(jìn)樣量：3μL；柱溫：35℃；流速：0.3 mL/min。洗脫程序見表1，其中流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為乙腈。

表1 流動相梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：選用ESI+電離模式，離子源電壓為4 200 V，離子源溫度為380℃，掃描模式為多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)，其他質(zhì)譜檢測參數(shù)見表2。

表2 5種AGs質(zhì)譜檢測的參數(shù)

1.2.5 方法學(xué)驗證

配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列，在上述設(shè)定的實驗條件下，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作、穩(wěn)定性與重復(fù)性實驗和加標(biāo)回收實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

比較ZIC-HILIC柱、Obelisc R柱以及BEH-HILIC柱發(fā)現(xiàn)，ZIC-HILIC柱和ObliscR柱對5種AGS組分的分離效果較好，其中ZIC-HILIC柱在流動相為乙腈：150 mmol/L乙酸銨-1.0%甲酸(20∶40∶40v/v/v)，條件下5種目標(biāo)物的響應(yīng)值最高；使用Obelisc R柱時，采用0.1%甲酸-乙腈作為流動相，梯度洗脫的模式下，也可以實現(xiàn)氨基糖苷類藥物的分離。

在上述兩種色譜柱優(yōu)化的條件下，分別比較兩種色譜柱的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)MRM圖，如圖1所示。從圖1可以看出，鏈霉素和雙氫鏈霉素在色譜圖上均不能很好的分離，但可以通過質(zhì)譜分析中不同離子對進(jìn)行區(qū)分，其中使用Obelisc R柱分析時各組分的靈敏度優(yōu)于ZIC柱。

圖1 5種AGs在兩種色譜柱中的MRM圖

2.2 基質(zhì)固相分散條件優(yōu)化

結(jié)果如圖2所示，洗脫液為甲酸溶液時，5種AGs組分回收率最高，其次為水，效果最差的為乙腈，主要是由于5種化合物組分為堿性物質(zhì)，洗脫液為酸性時目標(biāo)組分容易被洗脫。甲酸溶液作為洗脫液時，進(jìn)一步優(yōu)化最佳濃度，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，當(dāng)甲酸溶液濃度選擇0.1%時，各個組分的AGs回收率均較好（回收率達(dá)到77.2%～93.6%），進(jìn)一步增加甲酸溶液濃度，5種AGs回收率反而會下降。

圖2 3種洗脫液對回收率的影響

圖3 洗脫液濃度對回收率的影響

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

乳制品樣品中的干擾基質(zhì)較多，如磷脂、蛋白質(zhì)、脂肪等，為了減少此類物質(zhì)對質(zhì)譜檢測器產(chǎn)生基質(zhì)干擾，本試驗前處理采用乙腈、乙腈-甲酸混合溶液淋洗掉樣品中的干擾物，并優(yōu)化淋洗液中甲酸溶液的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，依次以2 mL乙腈、2 mL乙腈-1.0%甲酸（95∶5，v/v）、2 mL乙腈-1.0%甲酸（90∶10，v/v）、2 mL乙腈-1.0%甲酸（85∶15，v/v）的步驟來淋洗效果最佳，淋洗好后以2 mL0.1%甲酸溶液洗脫得到洗脫液。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

如表3所示，5種AGs線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）在0.9991～0.9999之間，方法的檢出限為2.5～25μg/kg，定量限為8.0～80μg/kg。

表3 5種AGs的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.4.2 穩(wěn)定性與重復(fù)性

在最優(yōu)條件下，對雙氫鏈霉素和卡那霉素30 ng/mL，大觀霉素60 ng/mL，鏈霉素和阿米卡星300 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HILIC分析，每天測定3次，連續(xù)一周。結(jié)果表明，5種化合物組分的測得結(jié)果日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%~3.6%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%~8.7%，說明該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好。

2.4.3 加標(biāo)回收實驗

分別添加2倍定限量、5倍定限量和10倍定限量低、中、高的3個水平混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（大觀霉素加標(biāo)量32、80、160μg/kg；鏈霉素和阿米卡星加標(biāo)量160、400、800 μg/kg、雙氫鏈霉素和卡那霉素濃度加標(biāo)量16、40、80μg/kg），測定并計算加標(biāo)加收率。結(jié)果如表4所示，5種化合物組分的AGs平均加標(biāo)回收率范圍在80.5%～94.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.4%～7.1%，滿足實驗要求。

表4 方法的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

2.5 實際樣品的檢測

將本方法應(yīng)用于從超市中隨機(jī)抽取的5種品牌共40份乳制品樣品，檢測5種AGs目標(biāo)組分。。結(jié)果顯示5種AGs殘留含量均低于50μg/kg，滿足國家標(biāo)準(zhǔn)限量要求。

3 結(jié) 論

本文建立的基質(zhì)固相分散-親水交互作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定乳制品中5種AGs殘留的分析方法，在對色譜的條件、基質(zhì)固相分散條件、基質(zhì)效應(yīng)等因素進(jìn)行優(yōu)化后，5種AGs能在2~2 000 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，5種組分的檢出限范圍為2.5～25μg/kg，定量限范圍為8.0～80μg/kg，加標(biāo)回收率在80.5%～94.3%。所建立的方法有效解決了檢測氨基糖苷類抗生素時反相色譜柱上保留性能不佳、回收率低的分析難點，可為乳制品中5種AGs殘留的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。