阿曼·阿爾斯蘭

（新疆藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，新疆烏魯木齊 830054）

天山堇菜（Viola tianshanica）為多年生草本植物，屬于堇菜科堇菜屬，生長(zhǎng)于海拔3 000 m 以上的山坡草地和高山，主要分布于中國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)。天山堇菜作為維吾爾族醫(yī)藥在新疆被廣泛使用，主要用于治療感冒發(fā)燒、疔瘡腫毒、祛風(fēng)清熱、淋巴腫大等[1]。天山堇菜全草中的活性成分主要包括揮發(fā)油[2]、氨基酸、香豆素類化合物[3]、生物堿和黃酮類化合物[4-5]。

隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)代分析儀器已逐步應(yīng)用于中草藥中活性物質(zhì)的定性、定量分析中。劉麗霞等[6]使用高效液相色譜法對(duì)中藥了哥王中傘形花內(nèi)酯的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，該方法適用于了哥王藥材的質(zhì)量控制，測(cè)得傘形花內(nèi)酯質(zhì)量濃度為0.6～24.0 mg/L。Miean 等[7]對(duì)62 種食用熱帶植物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)洋蔥中含有的黃酮類物質(zhì)最多，其中槲皮素1 497.5 mg/kg，山柰酚832.0 mg/kg。張?zhí)m等[8]基于毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法對(duì)中藥石韋中的槲皮素和綠原酸進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定，在最優(yōu)電泳介質(zhì)下（pH 7.0，10.0 mmol/L 磷酸鹽緩沖液）8 min內(nèi)完全分離。馬曉麗等[9]采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定天山花楸中的黃酮類化合物，在緩沖體系為10 mmol/LNa2B4O7-20 mmol/LNaH2PO4的條件下對(duì)槲皮素、金絲桃苷和蘆丁進(jìn)行了檢測(cè)，分離效果良好。曹煒等[10]使用HPLC 法對(duì)蜂膠中白楊素進(jìn)行了測(cè)定，建立了一種靈敏、準(zhǔn)確的分析方法，樣品中白楊素的含量為2.3%～5.6%。

于健東等[11]為分離檢測(cè)天山堇菜中的活性成分，通過HPLC 法測(cè)定維吾爾藥天山堇菜中七葉內(nèi)酯的含量，結(jié)果表明，天山堇菜中七葉內(nèi)酯的平均含量為0.09%。用醋酸乙酯萃取天山堇菜中的活性成分，結(jié)合核磁共振得到了七葉內(nèi)酯、白楊素、傘形花內(nèi)酯和豆甾醇；用正丁醇萃取天山堇菜中的活性成分，成功地從正丁醇中分離得到了山柰酚、槲皮素和胡蘿卜苷等物質(zhì)。但目前，基于毛細(xì)管電泳法同時(shí)分離白楊素、傘形花內(nèi)酯、七葉內(nèi)酯、山柰酚和槲皮素的相關(guān)研究還鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)基于毛細(xì)管電泳技術(shù)，建立了一種能夠同時(shí)檢測(cè)分離白楊素、傘形花內(nèi)酯、七葉內(nèi)酯、山柰酚和槲皮素的方法，并將其用于天山堇菜實(shí)際樣品的檢測(cè)中。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

天山堇菜樣品，購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院。

1.2 試劑與儀器

甲醇、乙腈、白楊素、槲皮素、山柰酚、傘形花內(nèi)酯、七葉內(nèi)酯，色譜純，購(gòu)自Sigma-Aldrich（美國(guó)）；氫氧化鈉、硼砂等，分析純，購(gòu)自Sigma-Aldrich（美國(guó)）。

AP/ACETM MDQ 毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，Beckman，配備有二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；熔融石英毛細(xì)管柱，永年銳灃色譜器件有限公司，使用32 Karat 軟件處理數(shù)據(jù)；KQ-250B 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；MilliQ-Gradient 超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

毛細(xì)管柱為未涂層熔融石英毛細(xì)管，總長(zhǎng)度為58.5 cm，內(nèi)徑為100 μm，有效長(zhǎng)度為48.5 cm；對(duì)于新毛細(xì)管柱，先用色譜純甲醇溶液沖洗10 min，然后用去離子水沖洗2 min，再用0.1 mol/L NaOH 溶液沖洗25 min，最后用去離子水沖洗5 min。

實(shí)驗(yàn)中采用的緩沖液為含20%乙腈的30 mmol/L的硼砂溶液。依次用0.1 mol/L NaOH、去離子水和緩沖液沖洗毛細(xì)管柱2 min，分離電壓為12 kV，檢測(cè)時(shí)間為30 min，0.5 psi（3.45 kPa）壓力進(jìn)樣5.0 s，檢測(cè)溫度為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為198 nm。

分別稱取白楊素、山柰酚、槲皮素、傘形花內(nèi)酯和七葉內(nèi)酯的標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg，用甲醇溶解，配制濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃避光儲(chǔ)存。用超純水進(jìn)行稀釋，配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取少量干燥的天山堇菜樣品研磨至均勻的粉末，準(zhǔn)確稱取0.1 g 該樣品于離心管中，加入10 mL 甲醇，超聲提取30 min，離心，將上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，備用，保存于4 ℃冰箱內(nèi)。

1.4 方法學(xué)考察

在確定的電泳分離條件下，對(duì)本方法的精密度（日內(nèi)精密度、日間精密度）、線性、重現(xiàn)性（日內(nèi)重現(xiàn)性、日間重現(xiàn)性）、加標(biāo)回收率進(jìn)行考察。

1.5 天山堇菜中活性物質(zhì)含量測(cè)定

在最優(yōu)電泳分離條件下對(duì)天山堇菜樣品中七葉內(nèi)酯、傘形花內(nèi)酯、山柰酚、白楊素和槲皮素進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品毛細(xì)管電泳圖

5 種活性物質(zhì)的電泳圖如圖1 所示，出峰順序?yàn)榘籽蛩?、七葉內(nèi)酯、傘形花內(nèi)酯、山奈酚、槲皮素。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的毛細(xì)管電泳圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度

如表1 所示，各色譜峰日內(nèi)精密度遷移時(shí)間的RSD不超過1.36%，峰面積的RSD不超過5.50%；日間精密度遷移時(shí)間的RSD不超過1.37%，峰面積的RSD不超過5.70%，日內(nèi)精密度和日間精密度均良好。

2.2.2 線性考察本方法對(duì)5 種活性成分的線性關(guān)系如表2 所示，5 種成分均線性關(guān)系良好。

2.2.3 重現(xiàn)性考察

從表3 可以看出，日內(nèi)重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)中，各色譜峰遷移時(shí)間的RSD不超過1.18%，峰面積的RSD不超過7.48%，日內(nèi)重現(xiàn)性良好；日間重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)中，各色譜峰遷移時(shí)間的RSD不超過3.62%，峰面積的RSD不超過11.99%，日間重現(xiàn)性良好。

2.3 天山堇菜中活性物質(zhì)含量測(cè)定

如圖2 所示，天山堇菜中僅檢測(cè)出七葉內(nèi)酯、傘形花內(nèi)酯和山柰酚3 種活性成分，白楊素和槲皮素未檢出。為考察本方法的加標(biāo)回收率，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)5 種活性物質(zhì)的含量對(duì)天山堇菜提取液進(jìn)行加標(biāo)。如表4所示，通過加標(biāo)指認(rèn)，天山堇菜提取液中含有七葉內(nèi)酯、傘形花內(nèi)酯和山柰酚，含量分別為20～50 μg/g、30～70 μg/g、220～250 μg/g。

表1 精密度考察結(jié)果

表2 線性關(guān)系考察

表3 重現(xiàn)性考察結(jié)果

表4 加標(biāo)回收率檢測(cè)（n=3）

圖2 天山堇菜提取液毛細(xì)管電泳圖

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在在緩沖液為含20%乙腈的30 mmol/L的硼砂溶液，分離電壓為12 kV，電泳時(shí)間為30 min，0.5 psi（3.45 kPa）壓力進(jìn)樣5.0 s，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為198 nm，檢測(cè)溫度為25 ℃的電泳分離條件下下對(duì)天山堇菜中的白楊素、七葉內(nèi)酯、傘形花內(nèi)酯、山柰酚和槲皮素五種活性物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：天山堇菜中七葉內(nèi)酯含量為20～50 μg/g，傘形花內(nèi)酯含量為30～70 μg/g，山柰酚含量為220～250 μg/g。本實(shí)驗(yàn)基于毛細(xì)管電泳技術(shù)建立了一種快速、便捷的測(cè)定天山堇菜中活性成分含量的方法，同時(shí)，也為毛細(xì)管電泳技術(shù)在中草藥中活性成分的含量的應(yīng)用提供了研究依據(jù)。