王智儀，郭佳佳，曹智威，馮亞莉

（鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，河南鄭州 451100）

木犀草素（3',4',5,7-四羥基黃酮）是一種天然的抗氧化劑，具有多種生物活性，如抗癌、抗菌、抗炎、心血管保護(hù)、改善和治療阿爾茨海默癥等[1-3]，具有廣泛的醫(yī)藥價值和應(yīng)用前景?；ㄉ鷼な悄鞠菟氐睦硐雭碓粗?，我國是花生生產(chǎn)、消費和出口貿(mào)易最大的國家，花生加工業(yè)每年產(chǎn)出大量的花生殼，僅有少量用作飼料或化工原料，既嚴(yán)重污染環(huán)境，又造成浪費。因此，開發(fā)利用花生殼中的天然黃酮類化合物木犀草素，對于有效延長花生產(chǎn)業(yè)鏈、提高花生資源綜合利用效益具有重要的社會意義。如圖1 所示，為木犀草素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖1 木犀草素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

傳統(tǒng)的水浴回流法、有機溶劑提取法及堿水提取法等存在得率較低的問題，微波輔助法和超聲波輔助法能耗和成本較高，酶輔助提取法及離子液提取技術(shù)操作繁瑣，不適于工業(yè)生產(chǎn)。本文采用連續(xù)萃取法提取花生殼中的木犀草素，考察不同萃取劑、萃取劑用量、萃取溫度及萃取時間等因素對木犀草素提取率的影響，采用高效液相法對最佳提取條件下的花生殼中木犀草素的提取率及產(chǎn)品純度進(jìn)行測定。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

花生殼購于河南省鄭州市，粉碎備用；木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品（98%），上海麥克林生化科技有限公司；甲醇，色譜級，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他所用試劑均為分析純。

萃取器，鄭州市高等學(xué)校生藥學(xué)名師技術(shù)技能工作室自制；Agilent-1260 型高效液相色譜儀：美國Agilent 公司。

1.2 實驗方法

稱取50 g 花生殼干粉于500 mL 燒杯中，加入200 mL 石油醚，攪拌密封后過夜，進(jìn)行脫脂處理。過濾，花生殼自然揮干后置于萃取器中，加入1 000 mL 75%乙醇，加熱回流，控制溫度為80 ℃，連續(xù)提取2 h。萃取完成后，濃縮提取液至浸膏狀，加入10 倍體積蒸餾水，靜置后取沉淀置于50 ℃恒溫干燥箱烘干，丙酮、乙酸乙酯重結(jié)晶，干燥，得木犀草素粗品。

1.3 萃取劑種類的選擇

萃取溫度為80 ℃，萃取時間為2.0 h，考察不同萃取劑對花生殼中木犀草素含量的影響。由于木犀草素分子結(jié)構(gòu)中有多個酚羥基，屬于弱酸性黃酮類化合物，為弱極性分子，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑以及稀堿溶液，因此選用75%乙醇溶液、75%甲醇溶液、75%丙酮溶液、乙酸乙酯、0.2 mol/L NaOH 溶液作為萃取劑。

1.4 萃取劑用量的選擇

固定萃取溫度為80 ℃，萃取時間為2.0 h，萃取劑為75%乙醇溶液，考察萃取劑用量對花生殼中木犀草素提取率的影響，按料液比（g/mL）為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 進(jìn)行實驗。

1.5 萃取溫度的選擇

固定料液比（g/mL）為1 ∶20，萃取時間為2.0 h，萃取劑為75%乙醇溶液，考察萃取溫度對花生殼中木犀草素提取率的影響，萃取溫度分別是40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃。

1.6 萃取時間的選擇

固定料液比（g/mL）為1 ∶20，萃取溫度為80 ℃，萃取劑為75%乙醇溶液，考察萃取時間對花生殼提取物中木犀草素提取率的影響，萃取時間分別是0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h。

1.7 HPLC 法測含量

1.7.1 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg，適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至1 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，超聲混勻，得濃度為1 mg/mL 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液[4]。

供試品溶液：取木犀草素粗品1.00 mg，適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至1 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，超聲混勻，得1 mg/mL 的供試品溶液[4]。

1.7.2 色譜條件選擇

色譜柱：ZORBAXSB-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.5%磷酸溶液（體積比70 ∶30），流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長(λ)：348 nm。

1.7.3 線性關(guān)系考察

取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液于50 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按“1.3.2”色譜條件依次進(jìn)樣分析，平行測定5 次，取平均值。以木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，進(jìn)行線性關(guān)系考察。

1.7.4 木犀草素含量測定方法

對木犀草素供試品溶液進(jìn)樣測定，測定結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算木犀草素濃度，并按照公式（1）～（2）計算木犀草素供試品純度ω和木犀草素提取率W。

式（1）中，V為供試品溶液的體積，mL；m1為稱取的木犀草素供試品質(zhì)量，mg。式（2）中，m2為提取的木犀草素產(chǎn)品總質(zhì)量，mg；m為實驗稱取的花生殼質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=29 538X+380.98，R2=0.9974。結(jié)果表明，木犀草素在濃度為0.0625～1.000 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示：

圖2 木犀草標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同萃取劑對木犀草素提取率的影響

如表1 所示，75%乙醇溶液作為萃取劑提取的木犀草素提取率最高，75%丙酮溶液次之，因此選擇75%乙醇溶液作為萃取劑。

表1 不同萃取劑花生殼提取物中木犀草素的含量

2.3 萃取劑用量對木犀草素提取率的影響

如圖3所示，木犀草素提取率隨料液比的降低（萃取劑用量增大）而提高，在1 ∶5～1 ∶20 時，木犀草素的提取率增加較快，而當(dāng)料液比大于1 ∶20 并進(jìn)一步提高時，木犀草素提取率的增加趨勢逐漸變緩。因此，當(dāng)萃取劑是花生殼質(zhì)量的20 倍時，即料液比（g/mL）為1 ∶20 時，萃取效果較好。

2.4 萃取溫度對木犀草素提取率的影響

圖3 料液比對木犀草素提取率的影響

如圖4 所示，萃取溫度對木犀草素提取率的影響較大：當(dāng)萃取溫度低于80 ℃時，木犀草素提取率隨溫度的升高而增大，而當(dāng)萃取溫度高于80 ℃時，木犀草素提取率隨溫度的升高反而有所降低。這是由于在溶劑乙醇溶液提取溶質(zhì)木犀草素的過程中，溫度既影響溶質(zhì)在溶劑中的溶解速度，又影響溶質(zhì)向外擴散的速度。另外，溫度的升高也會提高木犀草素在萃取劑中的溶解度。但是由于木犀草素為黃酮類化合物，對熱比較敏感，高溫會加速其氧化，所以萃取溫度并非越高越好。根據(jù)實驗結(jié)果可知，當(dāng)萃取溫度為80 ℃左右時，萃取效果較好。

圖4 萃取溫度對木犀草素提取率的影響

2.5 萃取時間對木犀草素提取率的影響

如圖5 所示，隨著萃取時間的增加，木犀草素的提取率也增加，但是當(dāng)時間超過2.0 h 時，木犀草素的提取率呈降低趨勢。這是由于長時間的加熱會造成木犀草素受熱氧化，從而使得木犀草素提取率降低，因此，選擇萃取時間為2.0 h 效果較好。

2.6 木犀草素含量測定

由1.7.4 式（1）和式（2）計算可得，花生殼中木犀草素提取率為0.32 mg/g，純度為67.86%。

3 結(jié)論

以75%乙醇溶液為萃取劑，采用連續(xù)萃取法從花生殼中提取木犀草素，料液比（g/mL）為1 ∶20，萃取溫度為80 ℃，萃取時間為2.0 h 時，提取率可達(dá)到0.32 mg/g，純度可達(dá)到67.86%。該方法節(jié)省溶劑，操作簡單，工藝流程短，提取率高，含雜質(zhì)少，殘渣少，耗能小，符合綠色環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展原則，經(jīng)濟(jì)和社會效益顯著，具有省工省時、便于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點。