向圣萍，邵闖，王慧敏1,*

（1.江漢大學(xué)持久性有毒污染物環(huán)境與健康危害湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430056；2.湖北省城市礦產(chǎn)資源循環(huán)利用工程技術(shù)研究中心,湖北荊門 448000；3.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢430064）

重金屬污染由于其毒性、非生物降解性和普遍性等特點(diǎn)，是目前最重要的環(huán)境問題之一。重金屬可以通過工業(yè)廢水和廢渣等方式進(jìn)入空氣和土壤，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，威脅著人類的健康和生態(tài)系統(tǒng)[1]。重金屬種類主要包含有3 種：有毒金屬（Cr、Cu、Zn、Hg、Ni、Cd、Pb、Co、Sn 等）、貴金屬（Pd、Ag、Au、Pt、Ru 等）以及放射性核素（U、Th、Ra、Am 等）[2]。其中，銅離子普遍存在于電鍍、采礦和金屬加工等各種工業(yè)廢水中，很難從水體中去除，最終可以通過食物鏈積累到人體中[3]。目前，從水溶液中去除重金屬的方法主要有化學(xué)沉淀法、化學(xué)氧化法、離子交換法、蒸發(fā)法、電鍍法和膜處理法等[4]。然而，這些方法可能會(huì)產(chǎn)生二次有毒化學(xué)污泥，或者效率低、價(jià)格昂貴，尤其是在低濃度的情況下。生物吸附法處理污水中重金屬污染，因具有效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)而受到人們的廣泛關(guān)注[5]。

目前，多種生物吸附劑已被用于去除和回收水溶液中的金屬離子，包括細(xì)菌、真菌、酵母、藻類，甚至植物[6]。其中，芽孢桿菌屬（Bacillus subtilis）[7]、微桿亞鐵氧化菌屬（Microbacterium sp.）[8]和假單胞菌屬（Pseudomonas putida）[9]等多種細(xì)菌都具有較強(qiáng)的銅離子生物吸附能力。由于假單胞菌具有易培養(yǎng)、較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性以及銅離子吸附能力強(qiáng)等優(yōu)良性能，因此篩選和開發(fā)新的假單胞菌吸附劑并在重金屬污染修復(fù)中運(yùn)用具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本文通過梯度馴化和富集培養(yǎng)從重金屬污水中篩選吸附銅離子的菌株，并通過單因素實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡路徑試驗(yàn)和Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件，使得菌株對銅離子溶液表現(xiàn)出高效的吸附性能。

1 材料與方法

1.1 材料

供試重金屬污水采集于荊門市城南污水處理有限公司。

1.2 設(shè)備與試劑

HZQ-Q 型恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱，哈爾濱東勝電子技術(shù)開發(fā)有限公司；722 型可見光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HPP9052 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；CR21GM 型超速冷凍離心機(jī)，日立Hitachi；FA1104 型電子天平，上海浦春計(jì)量儀器有限公司；JBM-7100F 型場發(fā)射掃描電鏡，日本電子株式會(huì)社（JEOL）捷歐路；ICAP7200 型電感耦合等離子光譜發(fā)生儀，賽默飛Thermo。

葡萄糖、蔗糖、硫酸銨、氯化銨、硫酸銅、NaCl、Na2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O，分析純，采購于中國國藥化學(xué)集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；麥芽糖、乳糖、淀粉、尿素，分析純，采購于中國阿拉丁試劑（上海）有限公司；胰蛋白胨、酵母粉、玉米漿為試劑級，豆粕、牛肉膏為生物試劑級，采購于上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 重金屬污水中銅離子吸附細(xì)菌篩選鑒定及表征

1.3.1 銅離子吸附細(xì)菌的篩選

取160 mL供試重金屬污水放入滅菌的錐形瓶中，加入20 mL 滅菌的LB 培養(yǎng)基（胰蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 10.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 7.0）和20 mL 400 mg/L 滅菌的硫酸銅溶液。28 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)5 d 后，取出40 mL 培養(yǎng)液，再次加入20 mL滅菌的LB 培養(yǎng)基和20 mL 400 mg/L 滅菌的硫酸銅溶液，如此循環(huán)5 次。最后，取出培養(yǎng)液，采用平板稀釋法涂布在100 mg/L 的LB 固體培養(yǎng)基平板上，篩選單菌落。

1.3.2 銅離子吸附細(xì)菌的鑒定

將銅離子吸附細(xì)菌單菌落挑取至LB 培養(yǎng)基于28 ℃、150 r/min 條件下過夜活化。在LB 平板上劃線，28 ℃倒置培養(yǎng)3 d 后，觀察細(xì)菌菌落形態(tài)。革蘭氏染色、掃描電子電鏡（SEM）觀察和16SrDNA 鑒定方法參考Sun 等[10]方法進(jìn)行。

1.3.3 菌株生長曲線繪制

將菌株過夜活化后，按照接種量4.0%接種到發(fā)酵初始培養(yǎng)基（葡萄糖20.00 g，胰蛋白胨20.00 g，Na2SO44.00 g，K2HPO41.00 g，MgSO4·7H2O 1.00 g，pH 7.0），在28 ℃、150 r/min 條件下，測定不同培養(yǎng)時(shí)間OD600并繪制生長曲線。

1.3.4 菌株銅離子吸附能力測定

將菌株發(fā)酵液于8 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集菌體。使用無菌生理鹽水洗滌2 次并重懸，調(diào)整菌懸液OD600=1.0。再次離心，使用100 mg/L 硫酸銅溶液重懸。28 ℃、150 r/min 處理2 h 后，8 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清液。上清過濾除菌后，使用電感耦合等離子光譜發(fā)生儀檢測溶液中銅離子濃度，采用以下公式計(jì)算銅離子去除率。

式（1）中，A表示銅離子去除率，%；C0表示初始溶液中銅離子初始濃度，mg/L；Ct表示菌株處理后溶液銅離子濃度，mg/L。

1.3.5 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

單因素實(shí)驗(yàn)：分別使用不同碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和淀粉）和不同氮源（胰蛋白胨、酵母粉、玉米漿、牛肉膏、尿素、硫酸銨、氯化銨和豆粕），對發(fā)酵初始培養(yǎng)基進(jìn)行單一成分改變。菌株接種到1 L發(fā)酵培養(yǎng)基后，28 ℃、150 r/min 培養(yǎng)20 h 后，測定銅離子吸附能力。

參考文獻(xiàn)[11]，以菌濃度OD600=1.0 時(shí)，菌株對100 mg/L 銅離子溶液的吸附率為指標(biāo)，進(jìn)行最陡爬坡路徑試驗(yàn)和Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，并使用SAS 9.2軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅離子吸附菌株的篩選與鑒定

通過銅離子梯度馴化富集培養(yǎng)和平板梯度稀釋涂布法，從重金屬污水中篩選到一株菌株，命名為MEW079。MEM079 菌株在LB 固體培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)24 h 后，菌落形態(tài)為菌落隆起、白色不透明、邊緣整齊，革蘭氏染色顯示為陰性。將MEM079 菌株在LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，SEM 觀察如圖1A 所示。SEM 圖顯示MEM079 菌為桿狀，尺寸為（0.3～0.6）μm×（1.0～2.5）μm。對MEW079 菌株進(jìn)行了16S rDNA 測序，序列已提交至NCBI，登錄號為KY462186。序列經(jīng)過Ezbiocloud[12]比對后，使用MEGA6.0 軟件對具有較高序列相似度的典型菌株進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建了16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1B 所示：MEW079 菌株16SrDNA 與Pseudomonas asiaticaRYU5 和Pseudomonas taiwanensisBCRC 17751的16S rDNA 序列相似性最高，均達(dá)到了99.65%。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)和16S rDNA 多序列比對分析，將MEW079 菌株歸屬為Pseudomonas sp.。

圖1 MEW079 菌株鑒定結(jié)果

2.2 MEW079 菌株的生長曲線測定

如圖2 所示，MEW079 生長曲線可被劃分為以下4 個(gè)時(shí)期：0～2 h 適應(yīng)期；2～16 h 對數(shù)生長期；16～26 h 穩(wěn)定期；26 h 后進(jìn)入衰亡期。據(jù)此，選取20 h 為后續(xù)發(fā)酵條件優(yōu)化的培養(yǎng)時(shí)間。

圖2 MEW079 菌株生長曲線測定

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

如圖3 所示，發(fā)酵初始培養(yǎng)基培養(yǎng)后，MEW079菌株對銅離子溶液吸附率為68.18%±1.13%。在碳源方面，蔗糖促進(jìn)MEW079 菌株對銅離子吸附能力最強(qiáng)，吸附率為83.78%±4.61%。因此，選取蔗糖為最適碳源進(jìn)行下一步發(fā)酵條件優(yōu)化。在氮源方面，尿素促進(jìn)MEW079 菌株對銅離子吸附能力最強(qiáng)，為87.55%±1.51%；其次為酵母粉，對銅離子吸附率為82.12%±1.43%。由于尿素為單一氮源時(shí)，菌株生長活性較弱，加入酵母粉后可以改善此問題，因此選擇尿素和酵母粉作為氮源進(jìn)行下一步發(fā)酵條件優(yōu)化。

圖3 不同碳源和氮源培養(yǎng)后對MEW079 吸附銅離子能力的影響

2.4 最陡爬坡路徑試驗(yàn)

如表1 所示，MEW079 菌株培養(yǎng)后，在菌濃度OD600=1.0 時(shí)，對100 mg/L 銅離子溶液的吸附率隨著蔗糖、酵母粉和尿素的添加量的增加先增加后下降。當(dāng)蔗糖濃度為21.0 g/L、酵母粉為9.5 g/L 和尿素為10.5 g/L 時(shí)，MEW079 菌株對銅離子的吸附率最高，達(dá)到了95.07%。因此，選擇此條件為響應(yīng)面BOXBehnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

表1 MEW079 菌株最陡爬坡路徑試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.5 Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

使用SAS 9.2 軟件對最陡爬坡路徑試驗(yàn)的最優(yōu)組進(jìn)行進(jìn)一步的二階優(yōu)化。如表2 所示，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)，給出了變量的水平、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和回歸分析結(jié)果。

將以上數(shù)據(jù)繪制響應(yīng)面圖，探討自變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系和相互作用。如圖4 所示，由于響應(yīng)面圖呈現(xiàn)立體圖向下指向，因此在選定的范圍內(nèi)存在極值，即響應(yīng)值的最高點(diǎn)。預(yù)測模型為：Y=-445.35+25.13X1+11.71X2+42.41X3-0.79X12+0.25X1X2+0.56X1X3-1.30X22+0.70X2X3-2.89X32。對方程兩邊求導(dǎo)，可得三元一次方程組（1）。

表2 響應(yīng)面Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

對方程組求解，得到X1=21.11，X2=9.37，X3=10.52。為了驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果，在最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。獲得的吸附率為95.87%，較68.18%的初始發(fā)酵條件下吸附率提高了27.69 個(gè)百分點(diǎn)。因此，MEW079 的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件如下：蔗糖21.11 g、酵母粉9.37 g、尿素10.52 g、Na2SO44.00 g、K2HPO41.00 g、MgSO4·7H2O 1.00 g，pH 7.0，接種量 4.0%，培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。

圖4 MEW079 菌株Box-Behnken 法響應(yīng)面圖

3 結(jié)論

本研究經(jīng)過梯度馴化富集培養(yǎng)后從重金屬污水中篩選到一株吸附銅離子的假單胞菌MEW079。蔗糖、尿素和酵母粉可以促進(jìn)MEW079 菌株對銅離子的吸附。采用最陡爬坡路徑試驗(yàn)和Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)條件，明顯提高了MEW079菌株對銅離子的吸附能力，最佳發(fā)酵條件為蔗糖21.11 g、酵母粉9.37 g、尿素10.52 g、Na2SO44.00 g、K2HPO41.00 g、MgSO4·7H2O 1.00 g，pH 7.0，接種量4.0%，培養(yǎng)溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。未來還需尋找合適的菌株固定化方法以實(shí)現(xiàn)其在工業(yè)上處理重金屬污水中的應(yīng)用。