吳珊，盧帥，劉軍，楊紹青，閆巧娟,#,*，江正強,#,*

a Key Laboratory of Food Bioengineering (China National Light Industry), College of Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

b Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

1. 引言

心血管疾病（CVD）是影響人類健康的重要因素，因CVD導致的死亡人數約占全世界死亡人數的三分之一。中風和冠心病主要是由血管阻塞引起的，血管阻塞會阻止血液流入大腦或心臟。因此，溶栓治療是預防CVD的有效方法[1]。在過去幾十年中，許多研究人員致力于安全和低價的抗血栓食品。發(fā)酵可以提高大豆食品的纖溶酶活性，包括中國的豆豉、日本的納豆和韓國的大豆醬[2]。由于微生物的作用使發(fā)酵大豆食品在風味和質地上有顯著改變[3]。細菌，特別是芽孢桿菌，是重要的產纖溶酶菌。已從食品中分離出產纖溶酶芽孢桿菌，如枯草芽孢桿菌[4]、解淀粉芽孢桿菌[5-7]、死亡谷芽孢桿菌Ace02 [8]和巨大芽孢桿菌KSK-07 [9]。枯草芽孢桿菌發(fā)酵的大豆在體內和體外均具有抗血栓形成作用[4,10]。解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌親緣性高，從中國的豆豉和韓國的醬油等發(fā)酵食品可以篩選到[5,10]。解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵過程中可生成一種纖溶酶-枯草桿菌蛋白酶[7]。許多豆類和谷物經芽孢桿菌發(fā)酵后，營養(yǎng)物質和活性成分以及生物活性都得到顯著提升[11]。迄今，采用解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵提升食物溶栓和抗凝血活性的相關研究較少[6]。

紅小豆是一種生存能力較強的豆類，具有抗旱性，生長周期較短并且栽培技術較簡單。紅小豆起源于亞洲熱帶地區(qū)，在印度、韓國、日本和中國華南地區(qū)都有種植。與同一種屬的其他豆類相比，紅小豆中的營養(yǎng)和活性物質含量較高[12]。紅小豆中富含酚類化合物，并具有抗氧化活性和降血糖等多種生理活性[13]。目前，大眾對紅小豆的接受程度較低，而紅小豆的高營養(yǎng)品質使其在食品市場上具有很大的發(fā)展?jié)摿14]。固態(tài)發(fā)酵具有生產率高、能耗低、發(fā)酵過程易于控制和無菌要求低的優(yōu)點[15]。本研究采用解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵紅小豆，并分析發(fā)酵對紅小豆的理化特性和抗氧化、降血糖、抗血栓等生物活性的影響。

2. 材料和方法

2.1. 實驗材料、試劑和菌種

紅小豆購自中國北京某超市，4 ℃下儲存直至使用。福林（Folin）-酚試劑、沒食子酸、6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸（Trolox）、2,2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）、2,2-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、三吡啶基三嗪（TPTZ）、尿激酶（10 KU，來自人腎細胞）、纖維蛋白原、二肽基肽酶IV（DPP-IV）和凝血酶（來自牛血漿）購于西格瑪奧德里奇公司（加拿大）。肝素鈉、蘆丁和阿卡波糖由拜爾迪生物技術有限公司（中國）提供。

解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118篩選自蘑菇醬，2018年7月3日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC NO.16050。

2.2. 紅小豆的發(fā)酵和提取

50 g紅小豆在去離子水中浸泡18 h。浸泡后的紅小豆在121 ℃下蒸煮，冷卻后接種不同濃度的解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118，40 ℃下固態(tài)發(fā)酵，根據纖溶酶活性優(yōu)化發(fā)酵條件。未接種解淀粉芽孢桿菌CAUNDJ118的紅小豆作為空白對照。發(fā)酵和未發(fā)酵的樣品冷凍干燥后，分別用去離子水[1/5（V/V）]、80%（V/V）乙醇和0.5% HCl的甲醇溶液進行萃取，收集提取液并在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3. 纖溶酶活性的測定

采用下述兩種方法分析纖溶酶活性。方法一為纖維蛋白降解方法[16]，凍干樣品按1/10 (m/V)加入生理鹽水，25℃水浴浸提2 h (200 r·min-1)，離心（10 000 r·min-1, 10 min）取上清液。分別取1.4 mL硼砂緩沖液（50 mmol·L-1, pH 8.5）和0.4 mL纖維蛋白原溶液（0.72%,m/V），混合后于37 ℃預熱5 min，加入0.1 mL凝血酶溶液（20 U·mL-1）于37 ℃水浴中反應10 min。加入適當稀釋的樣品上清液0.1 mL，于37 ℃水浴中繼續(xù)反應60 min后，加入0.2 mol·L-1三氯乙酸溶液2 mL終止反應，10 000 r·min-1離心10 min取上清液，275 nm下測定吸光值。將纖溶酶活性分析過程中先加入三氯乙酸終止反應后加入待測樣品上清液作為對照。每分鐘在275 nm處吸光度增加0.01所需酶量定義為1個纖維蛋白降解酶活力（FU）單位。纖溶酶活性表示為FU·g-1鮮重。

方法二是纖維蛋白平板法[17]。在硼酸鹽緩沖液中加入5 mL 0.4%纖維蛋白原、5 mL 0.8%瓊脂糖和1 mL凝血酶（200 U·mL-1），混勻后制備纖維蛋白平板。以尿激酶標準品制作標準曲線，計算樣品的纖溶酶活力相當量，結果表示為IU·g-1鮮重。

2.4. 紅小豆的物理性質

參照Shih等[18]的方法測定解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵紅小豆和未發(fā)酵紅小豆的硬度。將未發(fā)酵和發(fā)酵的紅小豆置于25 ℃室溫，采用質構儀（TMS-PRO；FTC，美國）測定硬度。測定方法：負載單元為25 000 g，探頭為TA4/1000 38.1-mm D，樣品平行放置，壓縮形變量為60%，觸發(fā)點負載為5 g，測試速度為1 mm·s-1，每個樣品平行測定9次后取平均值。第一次下壓區(qū)段內的最大力值即為樣品的硬度（g）。采用黏度計（DV-1黏度計；中國岳平）測定發(fā)酵紅小豆的動態(tài)黏度。將10 g樣品于100 mL去離子水中振蕩30 min提取黏稠物質，將20 mL提取物放入燒杯中測量黏度。采用掃描電子顯微鏡（SEM, S-3400N; HITACHI, Japan）觀察樣品的微觀結構，將樣品凍干粉進行鍍金膜處理，加速電壓為5 kV，放大倍率是1000×。

2.5. 紅小豆的化學特性

采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定樣品中還原糖含量[19]，以葡萄糖為標準品制作標準曲線，還原糖含量表示為g葡萄糖·100 g-1干豆。采用鄰苯二醛法測量樣品中多肽含量[20]，以Gly-Leu二肽為標準品繪制標準曲線。采用福林-酚比色法[13]分別測定樣品的醇提物（乙醇）總酚含量和總黃酮含量。使用pH示差法[21]測定樣品的0.5% HCl-醇提物（甲醇）中的花青素含量。制備樣品水提物，采用超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建城生物工程研究所，中國）測定水提物的SOD活性。將粉末狀樣品進行酸水解處理，使用日立L-8900氨基酸分析儀結合離子交換色譜和茚三酮柱后衍生法測定樣品中的氨基酸組成及含量[22]。采用17種氨基酸標準溶液（0.2 mmol·L-1）制作的標準曲線進行定量，樣品的氨基酸含量表示為mg·g-1干重。

2.6. 抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制、DPP-Ⅳ抑制和抗凝血活性分析

采用Dudonné等[23]的方法對樣品水提物和醇提物（乙醇）的抗氧化活性進行分析，測定DPPH和ABTS自由基清除活性和鐵離子還原抗氧化能力（FRAP），結果表示為μmol Trolox·g-1干重。

參照Shukla等[24]的方法測定樣品醇提物（乙醇）的α-葡萄糖苷酶抑制活性。將磷酸鹽緩沖液（0.1 mol·L-1, pH 6.8, 50 μL）、樣 品（30 μL）和α-葡 萄 糖 苷 酶（1.5 U·mL-1, 30 μL）的反應溶液在37 ℃恒溫箱中保溫10 min。加入硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（0.5 mmol·L-1, 40 μL）開始反應，在37 ℃恒溫箱中保溫40 min后加入Na2CO3（0.2 mol·L-1, 80 μL）終止反應。以不添加提取物樣品的反應液作為樣品對照，以不添加α-葡萄糖苷酶的反應液作為空白對照。測量反應液在405 nm處的吸光度，以阿卡波糖為陽性對照。根據公式（1）計算α-葡萄糖苷酶抑制活性：

式中，Acontrol為不添加提取物樣品的反應液的吸光度；Asample為含樣品反應液的吸光度；Acontrolblank為不添加α-葡萄糖苷酶的空白溶液的吸光度。

樣品水提取物的DPP-Ⅳ抑制活性參照Wang等[25]的方法進行測定，樣品提取液用0.1 mol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）稀釋后（25 μL）與25 μL 1.6 mmol·L-1Gly-Pro-對硝基苯胺溶液混合，在37 ℃恒溫箱中保溫10 min。加 入50 μL DPP-Ⅳ（8 U·L-1）后 將 反 應液在37 ℃下放置60 min，加入100 μL乙酸鈉緩沖液（1 mol·L-1, pH 4.0）終止反應。測量反應液在405 nm處的吸光度，根據公式（2）計算樣品的DPP-Ⅳ抑制活性：

式中，AB為不添加樣品提取液的反應液吸光度（空白組）；ABC和ASC分別為不添加DPP-Ⅳ的空白對照和樣品對照的反應液吸光度；AS為樣品組或陽性組的吸光度。

抗凝活性采用96孔微孔板法進行測定[26]。根據公式（3）進行計算抗凝活性：

式中，AC為不添加樣品的空白對照組反應液的吸光度（緩沖液代替樣品）；AS為樣品組反應液的吸光度；ACB和ASB分別為不添加凝血酶（緩沖液替代凝血酶）的空白對照和樣品對照組反應液的吸光度。

2.7. 統(tǒng)計分析

所有實驗均重復3次。結果以平均值±標準偏差表示。采用SPSS 20.0軟件（SPSS Chicago, IL, USA）對實驗數據進行單因素方差分析（ANOVA）和多重比較分析（Duncan），p＜ 0.05表示各組間差異顯著。

3. 結果與討論

3.1. 紅小豆發(fā)酵條件的優(yōu)化

紅小豆蒸煮10～50 min后接種解淀粉芽孢桿菌，接種量為1×105CFU·100g-1。固態(tài)發(fā)酵24 h后分析發(fā)酵紅小豆的理化特性和纖溶酶活性。如圖1（a）所示，隨著蒸煮時間的增加，紅小豆硬度降低（從2798 g到1058 g），纖溶酶活性和黏度增加。蒸煮40 min，纖溶酶活性（73.7 FU·g-1）和黏度（68.0 mPa·s）達到最大值。此外，本研究考察了活菌數和發(fā)酵時間對纖溶酶活性、硬度和黏度的影響，如圖1（b）和（c）所示，當活菌數為107CFU·100g-1、發(fā)酵時間為24 h時，最大的纖溶酶活性和黏度分別為78.0 FU·g-1（4890 IU·g-1，纖維蛋白平板法）和76.0 mPa·s，且發(fā)酵紅小豆的感官特征、黏度和風味與日本傳統(tǒng)的發(fā)酵大豆制品納豆相似[10]，發(fā)酵紅小豆的“氨”臭味比納豆淡。

在最適發(fā)酵條件下，發(fā)酵紅小豆的纖溶酶活性最大達78.0 FU·g-1（4890 IU·g-1，纖維蛋白平板法）。目前尚無纖溶酶活性測定的標準方法。纖維蛋白降解法和纖維蛋白平板法是最常用的纖溶酶活性測定方法。與纖維蛋白降解法相比，纖維蛋白平板法易于操作，但靈敏度較低。為了更好地與其他研究對比，本研究同時采用纖維蛋白降解法和纖維蛋白平板法兩種方法測定了解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵紅小豆的纖溶酶活性。通常，市售納豆的纖溶酶活性為20～40 FU·g-1[27]。在鷹嘴豆的固態(tài)發(fā)酵中，最優(yōu)發(fā)酵條件下纖溶酶活性達39.3 FU·g-1。研究發(fā)現(xiàn)其他發(fā)酵豆類也具有纖溶酶活性，如枯草芽孢桿菌和德氏乳桿菌乳酸亞種共同發(fā)酵的紅豆的纖溶酶活性可達28.2 FU·g-1（纖維蛋白降解法）[2]。采用纖維蛋白降解法和纖維蛋白平板法分別測得枯草芽孢桿菌發(fā)酵木豆的纖溶酶活性達1895.1 IU·g-1和53.0 FU·g-1[16,17]?？梢?，解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵紅小豆的纖溶酶活性遠高于商品納豆和其他發(fā)酵豆類。

圖1. 蒸煮時間（a）、活菌數（b）和發(fā)酵時間（c）對解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵紅小豆纖溶酶活性、黏度和硬度的影響。

3.2. 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵紅小豆的理化特性

優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵條件得到的紅小豆，其硬度下降（2194.6 g→1575.0 g），水分含量（60.5%→64.6%）、黏度（0.5 mPa·s→65.8 mPa·s）、還原糖含量（1.9 g葡萄糖·100 g-1干重→13.9 g葡萄糖·100 g-1干重）、肽含量（2.1 g·100 g-1干重→10.9 g·100 g-1干重）增加（表1）。紅小豆經解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵后，理化特性發(fā)生顯著變化，發(fā)酵紅小豆的黏度是未發(fā)酵紅小豆的131.6倍。Hu等[28]和Shih等[18]發(fā)現(xiàn)黑豆在發(fā)酵過程中黏度增加，而硬度降低。黏度是評價芽孢桿菌發(fā)酵豆類纖溶酶活性的重要指標，γ-聚谷氨酸是發(fā)酵大豆黏絲的主要成分之一[29]。本研究與Shih等[18]的研究結果一致，表明黏度與纖溶酶活性呈正相關（相關系數r= 0.986；p＜ 0.05，圖1），解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵紅小豆的過程中產生了具有纖溶酶活性的黏性物質。

與未發(fā)酵紅小豆相比，解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵紅小豆中的總酚（116.7～388.5 mg·100 g-1）、總黃酮（235.5～ 354.2 mg·100 g-1）和花青素含量（20.1～47.1 mg·100 g-1）增加了1.5～3.3倍（表1）。由于酚類化合物具有潛在的生物活性，近年來廣受關注。人們可以根據飲食來源和生活習慣補充每日所需酚酸和類黃酮化合物（20～1000 mg·d-1）[30]。發(fā)酵會釋放豆類中游離酚苷元，從而增加酚類化合物的總含量。研究表明發(fā)酵過程會增加黑豆（1.5倍）、鷹嘴豆（3.2倍）、大豆（1.7倍）和木豆（1.4倍）中的總酚含量（TPC）[6,16,31,32]。在枯草芽孢桿菌發(fā)酵黑豆的過程中產生的β-葡萄糖苷酶可水解酚苷元并釋放出酚羥基[6]。采用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵紅小豆的總酚含量提高了3.3倍（表1）。酚類化合物通常以結合形態(tài)存在于食品原料中，而結合型酚類化合物的生物活性通常低于游離型酚類化合物[31,33]。解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵紅小豆過程中β-葡萄糖苷酶從0.01 U·g-1提高至2.19 U·g-1（數據未列出）。因此，發(fā)酵紅小豆中總酚含量的增加可能是由于細胞壁釋放的結合型酚類物質引起的[23,31]。

如表1所示，發(fā)酵紅小豆的SOD活性顯著高于未發(fā)酵紅小豆，未發(fā)酵和解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵紅小豆的SOD活性分別為55.3 U·g-1干重和263.6 U·g-1干重，經解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵后紅小豆的SOD活性提高了4.8倍。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內清除自由基的主要物質[34]。納豆和發(fā)酵黑豆的SOD活性較未發(fā)酵顯著提高[35,36]。

表1 未發(fā)酵和發(fā)酵紅小豆的理化特性

未發(fā)酵紅小豆與解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵紅小豆的氨基酸組成及含量的結果如表2所示。兩個樣品都富含谷氨酸（34.8 mg·g-1和42.4 mg·g-1）和天冬氨酸（24.8 mg·g-1和24.2 mg·g-1），以及必需氨基酸亮氨酸（17.7 mg·g-1和17.9 mg·g-1）和賴氨酸（16.4 mg·g-1和16.4 mg·g-1）。發(fā)酵后紅小豆中精氨酸含量下降（7.8%），谷氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸的含量分別提高了21.8%、7.8%、35.0%、38.1%和3.2%。

表2 未發(fā)酵和發(fā)酵紅小豆的氨基酸組成

紅小豆發(fā)酵前后的掃描電鏡圖如圖2所示?？梢姡窗l(fā)酵紅小豆和發(fā)酵紅小豆的表面微觀結構存在顯著差異。未發(fā)酵紅小豆的表面雖然不平滑，但結構完整緊密[圖2（a）]。而發(fā)酵紅小豆顆粒骨架結構出現(xiàn)大面積剝落，表面結構被破壞，形成大量碎片，變得粗糙疏松，孔隙不均勻[圖2（b）]。

圖2. 未發(fā)酵（a）和發(fā)酵（b）紅小豆凍干粉掃描電鏡觀察圖，5 kV加速電壓，放大倍數為1000×。

3.3. 發(fā)酵對紅小豆生物活性的影響

3.3.1. 抗氧化活性

表3顯示了未發(fā)酵和發(fā)酵紅小豆的抗氧化活性。發(fā)酵紅小豆的醇提物（乙醇）具有最高的DPPH（17.1 μmol Trolox·g-1）和ABTS（185.5 μmol Trolox·g-1）清除活性，以及最高的FRAP值（28.8 μmol Trolox·g-1），其次是發(fā)酵紅小豆的水提物（分別為13.3 μmol Trolox·g-1、138.3 μmol Trolox·g-1和21.0 μmol Trolox·g-1）、未發(fā)酵紅小豆的醇提物（乙醇）（6.9 μmol Trolox·g-1、38.6 μmol Trolox·g-1和15.2 μmol Trolox·g-1）和未發(fā)酵紅小豆的水提物（3.9 μmol Trolox·g-1、29.0 μmol Trolox·g-1和10.1 μmol Trolox·g-1）。

由于自由基清除方法具有穩(wěn)定的重復性和高度的準確性，許多研究都將其作為評價抗氧化活性的模型[37]。芽孢桿菌發(fā)酵鷹嘴豆的醇提物（甲醇）DPPH清除活性顯著高于未發(fā)酵的鷹嘴豆[6]。用枯草芽孢桿菌發(fā)酵木豆，可提升其水提物的DPPH和ABTS清除活性以及FRAP值。紅小豆經解淀粉芽孢桿菌固體發(fā)酵后，其醇提物（乙醇）的DPPH、ABTS清除活性和FRAP值分別提高了2.5倍、4.8倍和1.9倍，水提物的DPPH、ABTS清除活性和FRAP值則分別提升3.4倍、4.8倍和2.1倍。未發(fā)酵或發(fā)酵紅小豆的醇提物（乙醇）的抗氧化活性顯著高于其水提物（表3）。研究表明，發(fā)酵食品中的酚類化合物與抗氧化活性直接相關[37]，紅小豆含有多種酚類化合物，在醇提物（乙醇）中共檢測到14種多酚類化合物，在水提物中共檢測到10種多酚類化合物[19]。由于多酚類化合物的結構多樣，不同溶劑提取的多酚類化合物組成也存在差異，這可能是解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵紅小豆的醇提物（乙醇）的抗氧化活性高于其水提物的原因。

表3 未發(fā)酵和發(fā)酵紅小豆的抗氧化活性

3.3.2. α-葡萄糖苷酶抑制活性

發(fā)酵紅小豆醇提物（乙醇）濃度為11.2 mg·mL-1（88.9%）時，α-葡萄糖苷酶抑制活性是未發(fā)酵紅小豆（27.5%）的3.2倍[圖3（a）]。

圖3. 未發(fā)酵和發(fā)酵紅小豆的α-葡萄糖苷酶抑制活性（a）和DPP-IV抑制活性（b），分別以阿卡波糖和抑二肽素A作為陽性對照。（a）和（b）中的樣品濃度分別為0.35～11.2 mg·mL-1和0.03～6.4 mg·mL-1。

α-葡萄糖苷酶抑制劑可改善2型糖尿病[24]。多酚類物質是常見的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑[37]。研究表明，紅小豆具有良好的抗糖尿病潛力[13]。解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵處理提高了紅小豆醇提物（乙醇）（11.2 mg·mL-1）的α-葡萄糖苷酶抑制活性[27.5%～88.9%；圖3（a）]。紅小豆醇提物（乙醇）中的多酚類和黃酮類化合物等生物活性物質隨著發(fā)酵時間的增加而增加（表 1）。未發(fā)酵和發(fā)酵紅小豆的水提物在同等濃度下并沒有檢測出α-葡萄糖苷酶抑制活性（數據未列出）。Shukla等[24]分析了多種發(fā)酵黃豆醬水提物（50 mg·mL-1）的α-葡萄糖苷酶抑制活性，然而其抑制活性較低（58.93～62.25%）。發(fā)酵紅小豆的α-葡萄糖苷酶抑制活性低于陽性對照阿卡波糖[圖3（a）]。與藥物相比，發(fā)酵紅小豆作為食品級α-葡萄糖苷酶抑制劑具有較大應用潛力。

3.3.3. DPP-Ⅳ抑制活性

紅小豆水提物的DPP-Ⅳ抑制活性如圖3（b）所示。在相同濃度下（6.4 mg·mL-1），發(fā)酵紅小豆水提物的DPP-Ⅳ抑制率（65.6%）顯著高于未發(fā)酵紅小豆水提物（30.2%）。DPP-IV可抑制胰島素分泌，通常用于預防和治療2型糖尿病[25]。豇豆、四季豆和班巴拉豆等已用于生產DPP-Ⅳ抑制肽[38-40]。與未發(fā)酵紅小豆相比，解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵紅小豆的DPP-Ⅳ抑制活性顯著提高1.6～2.2倍[圖3（b）]。此外，發(fā)酵紅小豆中含有較多的多肽（10.1 g·100 g-1）和多酚類化合物（388.5 mg沒食子酸·100 g-1；表1）。研究報道的食源性DPP-Ⅳ抑制劑多為蛋白質水解物、黃酮和酚酸類物質[41]。因此，發(fā)酵紅小豆可作為潛在具有DPP-Ⅳ抑制活性或預防2型糖尿病的功能性食品原料。

3.3.4. 抗凝血活性

未發(fā)酵和發(fā)酵紅小豆水提物的抗凝血活性如圖4所示。發(fā)酵紅小豆水提物抑制纖維蛋白的形成能力隨濃度的增加而增強（14.6%～98.2%）。未發(fā)酵紅小豆水提物的抗凝血活性（0～6.3%）顯著低于發(fā)酵紅小豆。發(fā)酵紅小豆可通過抑制凝血酶活性，阻礙纖維蛋白原轉變?yōu)槔w維蛋白從而抑制凝血。凝血是引起血栓性疾病的重要因素，安全低價的抗凝血功能食品備受關注[42]。研究表明，堿性蛋白酶水解花生蛋白的產物在40 mg·mL-1時表現(xiàn)出95%的高抗凝活性[26]。由解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵的鷹嘴豆在1 mg·mL-1時具有80%的抗凝活性，但仍低于陽性對照肝素鈉[6]。本研究中，由解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵的紅小豆的水提物濃度為1 mg·mL-1時，抗凝血活性為98.2%（圖4），顯著高于陽性對照肝素鈉（在1 mg·mL-1下為57.7%；圖4）。迄今，尚無解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵紅小豆的抗凝血活性的相關報道。在臨床，肝素鈉、華法林和阿司匹林是常用的抗凝血藥物。這些藥物存在安全性問題，可引發(fā)病患嚴重出血[43]。從發(fā)酵大豆中分離出的納豆激酶已被證明具有抗血栓作用[44]，且動物試驗和人體臨床試驗表明其為安全的抗血栓物質[6,9]。發(fā)酵紅小豆水提物具有抗凝血活性（圖4）和纖溶酶活性 （圖1），可作為膳食補充劑用于血栓性疾病的預防。

圖4. 未發(fā)酵和發(fā)酵紅小豆的抗凝血活性。肝素鈉作為陽性對照。樣品濃度范圍為0.03～1.0 mg·mL-1。

4. 結論

解淀粉芽孢桿菌可用于制作紅小豆發(fā)酵食品的發(fā)酵劑。發(fā)酵顯著改變了紅小豆的理化特性。發(fā)酵紅小豆的抗氧化活性、DPP-Ⅳ抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性均高于未發(fā)酵紅小豆。此外，發(fā)酵紅小豆的抗凝血活性也顯著提高。結果表明，解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵紅小豆具有開發(fā)功能性食品的潛力。

致謝

本研究得到了“十三五”國家重點研發(fā)計劃“現(xiàn)代食品加工及糧食收儲運技術與裝備”重點專項（2018YFD0400404）的資助。

Compliance with ethics guidelines

Shan Wu, Shuai Lu, Jun Liu, Shaoqing Yang, Qiaojuan Yan, and Zhengqiang Jiang declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.