關(guān)倩倩 ，熊濤 ，謝明勇 *

a State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang 330047, China

b College of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330031, China

1. 引言

以心腦血管疾病、癌癥、糖尿病和高血壓等為代表的慢性疾病正嚴(yán)重威脅著人類健康。2015年1月19日世界衛(wèi)生組織發(fā)布的最新報告[1]表明，2012年全球共有3800萬人死于慢性疾病，其中40%以上（即近1600萬人）的死亡屬于原本可以避免的過早死亡，該數(shù)字遠(yuǎn)高于2000年的過早死亡人數(shù)（1460萬人）。2018年中國國民健康與營養(yǎng)大數(shù)據(jù)報告[2]顯示，中國慢性疾病患者已經(jīng)超過2.6億人，致死率占死亡人口總數(shù)的85%左右。此外，慢性疾病還呈現(xiàn)發(fā)病率持續(xù)上升、發(fā)病年齡日益年輕化的趨勢。

早在20世紀(jì)初，諾貝爾獎獲得者IIya Mechnikov在研究人體腸道菌群時就提出了“衰老源于人體和腸道菌群中某些細(xì)菌產(chǎn)生的毒素”的理論。該理論與我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中“糞毒入血，百病蜂起”的觀念不謀而合。美國華盛頓大學(xué)的Turnbaugh等[3,4]和Ridaura等[5]通過對腸道菌群的長期研究，揭示了人體與腸道微生物之間的復(fù)雜關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)與營養(yǎng)不良、肥胖癥、糖尿病等疾病密切相關(guān)。這些研究成果為人們理解腸道菌群與人體健康之間的微妙關(guān)系提供了全新的視角。腸道菌群失調(diào)可引起胰島素抵抗和慢性炎癥的發(fā)生，從而導(dǎo)致代謝綜合征、肥胖癥、糖尿病甚至癌癥等慢性疾病[6-10]。除了腸道菌群失調(diào)，膳食纖維攝入不足是慢性疾病發(fā)生的另一大誘因。以美國為例，膳食纖維每日推薦攝入量為：成年男性38 g，女性25 g；而實(shí)際平均攝入量只有一半左右：男性18.7 g，女性15.6 g。我國居民日常膳食中每天僅攝入8～10g膳食纖維，遠(yuǎn)低于中國營養(yǎng)學(xué)會推薦的每日膳食纖維攝入量25～35g的標(biāo)準(zhǔn)。膳食纖維攝入不足會直接導(dǎo)致一些腸道微生物消失，進(jìn)而引起各種慢性疾病[11]。更為嚴(yán)重的是，膳食纖維缺乏所引起的腸道菌群失調(diào)和健康問題，是有可能會遺傳的；如果膳食纖維攝入持續(xù)不足，可能會導(dǎo)致腸道微生物不可逆轉(zhuǎn)的消失[12]。

增強(qiáng)國民體質(zhì)離不開健康食品產(chǎn)業(yè)的支撐。為推進(jìn)健康中國建設(shè)，提高人民健康水平，2016年10月25日，中共中央、國務(wù)院印發(fā)并實(shí)施《“健康中國2030”規(guī)劃綱要》（以下簡稱《綱要》），把國民身心健康提高到國家戰(zhàn)略的高度。隨著《綱要》的提出，大眾也越來越關(guān)注食品營養(yǎng)與健康，尤其是食品對腸道健康的影響。腸道是人體最重要的器官之一，人體有70%以上的黏膜免疫發(fā)生在腸道，通過復(fù)雜的免疫機(jī)制，腸道與全身各部位器官發(fā)生緊密的聯(lián)系。因此，要提升大眾健康水平必須高度關(guān)注腸道健康問題。

目前，益生菌、益生元有益腸道健康的理念已深入人心，益生菌與益生元的研究已成為涉及食品科學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、免疫學(xué)和腸道健康科學(xué)等多個領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。研究食物對腸道健康的影響，重點(diǎn)應(yīng)關(guān)注益生菌、益生元以及益生菌發(fā)酵食品對腸道健康的影響及其相互作用機(jī)制。近年來益生菌產(chǎn)品風(fēng)靡全球，據(jù)統(tǒng)計，全球已有包括益生菌發(fā)酵酸奶、益生菌膠囊、益生菌粉劑等超過380種的益生菌產(chǎn)品，其中益生菌發(fā)酵乳制品的比例高達(dá)80%。但目前市場上鮮見益生菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品，其主要原因就在于果蔬發(fā)酵專用菌種缺乏、果蔬發(fā)酵專用復(fù)合菌劑規(guī)模化制備技術(shù)落后等突出問題尚待解決。

2. 益生菌及其發(fā)酵技術(shù)研究現(xiàn)狀

自1899年法國Tissier博士發(fā)現(xiàn)第一株益生菌——雙歧桿菌[13]以來，科學(xué)家們從未停止過對益生菌與人體健康關(guān)系的探索。大量科學(xué)研究證實(shí)，口服益生菌有助于預(yù)防或者治愈胃腸炎、抗生素引起的腹瀉、旅行不適引起的腹瀉、便秘及腸道感染，同時可抑制有害微生物在宿主腸道中定植，對腸易激綜合征、炎癥性腸炎及結(jié)腸癌等腸道相關(guān)疾病也具有良好的預(yù)防和治療作用[14-17]。日本和歐美國家的大型乳業(yè)集團(tuán)和乳酸菌（LAB）制劑公司都開發(fā)出自主菌株及產(chǎn)品品牌，并對菌株的益生功能進(jìn)行了許多臨床試驗(yàn)。如丹麥Chr. Hansen公司開發(fā)的動物雙歧桿菌BB-12菌株是世界上臨床研究最為充分的雙歧桿菌菌株[18,19]。300多篇科學(xué)論文對該菌株進(jìn)行過描述，其中的130多篇涉及人體臨床試驗(yàn)。另一個例子是日本養(yǎng)樂多公司的干酪乳桿菌代田株[19]，在過去80多年中，日本對該菌株也開展了大量的科學(xué)研究與臨床試驗(yàn)。截止到2015年5月，其在腸道內(nèi)的存活性、有效性及安全性已經(jīng)在英國、日本、泰國、中國等多個國家和地區(qū)得到科學(xué)驗(yàn)證[20-25]。

國內(nèi)近年來在益生菌對腸道健康促進(jìn)作用方面的研究也日漸深入。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)的張和平團(tuán)隊[26]從內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵的酸馬奶中篩選到一株性能優(yōu)異的菌株Lactobacillus caseiZhang，并對其益生功能進(jìn)行了深入研究，結(jié)果表明：該菌株具有降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、拮抗腸道病原菌生長、抑制腫瘤細(xì)胞生長等優(yōu)良的益生特性。江南大學(xué)的陳衛(wèi)團(tuán)隊[27]構(gòu)建了功能性益生乳酸菌篩選模型，在此基礎(chǔ)上對篩選的植物乳桿菌ST-III的益生功能進(jìn)行了深入研究，結(jié)果表明：該菌株可在腸道中有效定植并能調(diào)節(jié)腸道菌群，在降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂等方面也具有優(yōu)良的益生特性。此外，關(guān)于益生菌發(fā)酵乳制品促進(jìn)腸道健康的研究報道較多，包括《美國臨床營養(yǎng)學(xué)雜志》在內(nèi)的多種權(quán)威期刊都相繼報道“每天喝發(fā)酵乳可提高人體免疫功能，減少過敏，降低炎癥性腸炎、膀胱癌、結(jié)腸癌的發(fā)病率等”[28-32]。目前，養(yǎng)樂多乳酸菌飲料、味全乳酸菌飲料等多款市售益生菌發(fā)酵乳制品在促進(jìn)人體腸道健康方面的功效已得到臨床驗(yàn)證[33-36]。

相對益生菌發(fā)酵乳制品，目前國內(nèi)外關(guān)于發(fā)酵果蔬制品對人體健康影響的研究較少。研究相對較多的是韓國泡菜，作為韓國“第一菜”，學(xué)者對其營養(yǎng)成分和保健功效研究較多。韓國學(xué)者報道了韓國泡菜在減肥、抗腫瘤、降膽固醇、降血脂等方面的健康功效[37]。此外，還有少數(shù)關(guān)于實(shí)驗(yàn)室自制益生菌發(fā)酵果蔬汁健康功效的研究報道。波蘭羅茲工業(yè)大學(xué)（Technical University of Lodz）的Klewicka等[38,39]對實(shí)驗(yàn)室自制的乳酸菌發(fā)酵甜菜汁改善大鼠腸道菌群、抗氧化功效開展了研究。重慶醫(yī)科大學(xué)的褚巧芳等[40]和管曉冉等[41,42]研究了實(shí)驗(yàn)室采用雙歧桿菌發(fā)酵的自制混合果蔬汁對小鼠免疫調(diào)節(jié)及抗疲勞作用的影響，結(jié)果均證實(shí)發(fā)酵果蔬汁在促進(jìn)大鼠、小鼠健康方面具有一定功效。

3. 果蔬益生菌發(fā)酵技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

將益生菌與果蔬相結(jié)合，可同時提供人體所需要的益生菌及膳食纖維，是未來益生菌產(chǎn)業(yè)的重要發(fā)展方向?！耙嫔?果蔬”形式多樣，其中最簡單的方式就是在現(xiàn)有的傳統(tǒng)果蔬產(chǎn)品中直接添加益生菌。例如，將益生菌直接添加到冷藏果蔬汁飲料中，冷鮮保存。此外，還可以在果蔬汁中添加一定量的益生菌發(fā)酵乳，將其加工成活菌或非活菌飲品。然而，對于胡蘿卜、苦瓜、芹菜等營養(yǎng)豐富但風(fēng)味不佳的蔬菜類原料，簡單添加益生菌并不能改善蔬菜產(chǎn)品本身欠佳的風(fēng)味。因此，“益生菌+果蔬”最好的方式莫過于采用果蔬發(fā)酵專用益生菌種對其原料進(jìn)行發(fā)酵。益生菌發(fā)酵可分解蔬菜原料中的大部分烯萜類物質(zhì)，有效改善蔬菜產(chǎn)品欠佳的風(fēng)味，同時還可產(chǎn)生大量的芳香醇、芳香酯等風(fēng)味物質(zhì)，使原料風(fēng)味與發(fā)酵風(fēng)味渾然一體，香味更加醇厚，口感更加柔和。另外，益生菌發(fā)酵還可產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸、黏性多糖和多肽等活性物質(zhì)，對改善便秘、緩解結(jié)腸炎、預(yù)防和治療消化道炎癥都有很好的作用。

盡管國內(nèi)外學(xué)者在發(fā)酵果蔬領(lǐng)域做了不少研究，但迄今為止，關(guān)于果蔬益生菌發(fā)酵技術(shù)研究仍處于起步階段，國內(nèi)外市場尚沒有品牌和質(zhì)量過硬的益生菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品出現(xiàn)。究其原因，果蔬益生菌發(fā)酵相關(guān)核心技術(shù)仍需突破以下瓶頸：①果蔬發(fā)酵專用菌種缺乏。眾所周知，保加利亞乳桿菌和嗜熱酸鏈球菌是用于酸奶發(fā)酵的菌種，而用于果蔬發(fā)酵的菌種尚不明確；盡管目前有越來越多的報道將植物乳桿菌[43-45]、嗜酸乳桿菌[46-48]等植物源乳酸菌株用于果蔬汁的發(fā)酵，但由于果蔬原料的多樣性，沒有哪種菌種可用于所有果蔬原料的發(fā)酵。許多特殊的果蔬，如藍(lán)莓的pH值低、花青素含量高，一般乳酸菌很難發(fā)酵。因此，非常有必要廣泛篩選適合不同種類果蔬原料發(fā)酵的菌種，建立果蔬發(fā)酵專用菌種庫。②適合工業(yè)化生產(chǎn)的菌種高密度培養(yǎng)技術(shù)缺乏。目前國內(nèi)外對乳酸菌的高密度培養(yǎng)技術(shù)研究多集中在膜過濾透析培養(yǎng)[49,50]、離子交換[51]、細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)[52,53]等技術(shù)，盡管可以達(dá)到細(xì)胞的高密度富集，但此類高密度培養(yǎng)技術(shù)僅限于實(shí)驗(yàn)室水平，很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[54]。近年來，分批培養(yǎng)或補(bǔ)料分批培養(yǎng)與培養(yǎng)基成分優(yōu)化相結(jié)合的方法越來越多地被用于乳酸菌的高密度培養(yǎng)，發(fā)酵液中乳酸菌的濃度一般可達(dá)到1 × 109～ 1 × 1010CFU·mL-1（CFU：菌落形成單位）[55,56]。③高活性工程菌劑規(guī)?；苽浼夹g(shù)落后。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報道的菌劑制備技術(shù)多采用真空冷凍干燥法，制備的菌劑產(chǎn)品中活菌數(shù)基本為1×1010～ 1×1011CFU·g-1[57-59]。

4. 本團(tuán)隊在果蔬益生菌發(fā)酵關(guān)鍵技術(shù)與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用方面的研究進(jìn)展

本團(tuán)隊長期致力于果蔬益生菌發(fā)酵關(guān)鍵技術(shù)與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用研究，從科學(xué)、技術(shù)、工程到產(chǎn)業(yè)化（STEI）全過程，突破了果蔬發(fā)酵菌種篩選、菌劑制備、新工藝產(chǎn)業(yè)化等技術(shù)瓶頸，創(chuàng)制了一個果蔬益生菌發(fā)酵上、中、下游全產(chǎn)業(yè)鏈的關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新體系（圖1），開發(fā)了具有“安全、營養(yǎng)、美味、方便”等鮮明特征的益生菌發(fā)酵果蔬全新系列產(chǎn)品，催生了一個全新的發(fā)酵果蔬綠色制造產(chǎn)業(yè)。在此基礎(chǔ)上，初步研究了益生菌及其發(fā)酵果蔬產(chǎn)品對腸道健康的影響，取得了一定進(jìn)展。

4.1. 果蔬發(fā)酵過程中多菌種協(xié)同發(fā)酵代謝調(diào)控機(jī)制

我們研究了我國各類傳統(tǒng)發(fā)酵果蔬在自然發(fā)酵過程中的菌系結(jié)構(gòu)及其消長規(guī)律，揭示了果蔬發(fā)酵過程中各主要發(fā)酵菌株及其代謝產(chǎn)物與發(fā)酵底物間的互作關(guān)系，闡明了果蔬發(fā)酵過程中多菌種協(xié)同發(fā)酵代謝調(diào)控機(jī)制，為優(yōu)良菌種的高通量篩選、復(fù)合菌劑制備和果蔬發(fā)酵生產(chǎn)工藝奠定了堅實(shí)的理論基礎(chǔ)[60-67]。

4.2. 果蔬發(fā)酵優(yōu)良益生菌種高通量篩選體系

基于上述理論基礎(chǔ)，本團(tuán)隊海量收集國內(nèi)外傳統(tǒng)發(fā)酵果蔬樣本近千份，并對傳統(tǒng)工藝及其微生物資源進(jìn)行了充分挖掘及標(biāo)準(zhǔn)化整理，分離、鑒定和保藏了56種6000多株乳酸菌（表1），建立了我國首個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的果蔬發(fā)酵專用菌庫，其中發(fā)酵性能優(yōu)良并具有多種功能特性的果蔬發(fā)酵專用益生菌有335株，這些菌株的胃酸和膽鹽耐受性強(qiáng)，腸道黏附性好，具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、緩解便秘、調(diào)節(jié)免疫等益生功能[68-78]。

表1 分離和保藏的56種乳酸菌

同時，選擇一株從我國傳統(tǒng)泡菜中篩選出的具有多種益生功能（耐胃腸道環(huán)境、降糖、降脂、降膽固醇、緩解便秘等）的果蔬發(fā)酵專用菌株——植物乳桿菌NCU116作為代表，采用第三代測序技術(shù)對其進(jìn)行全基因組測序，分析相關(guān)基因功能，并與植物乳桿菌WCFS1和植物乳桿菌JDM1作比較基因組分析。結(jié)果表明，植物乳桿菌NCU116和幾株已完成測序的植物乳桿菌有很大的相似性，但相比之下，植物乳桿菌NCU116基因組編碼大量糖酵解相關(guān)基因簇（NCU116GM001792、NCU116GM002858等）、PTS相關(guān)基因簇（NCU116GM003248、NCU116GM000887等）以及丙酸酮鹽相關(guān)及調(diào)控基因，使得植物乳桿菌NCU116既可以轉(zhuǎn)運(yùn)又能代謝單糖、二糖、低聚糖類和糖醇類碳源[79]；同時編碼ABC超家族轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的相關(guān)基因簇，這與植物乳桿菌NCU116表現(xiàn)出的耐酸、耐滲透壓等生理功能一致。NCU116基因組中未發(fā)現(xiàn)任何致病基因，與動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果契合，證明該菌株是一株安全可靠的益生菌株。

圖1. 果蔬益生菌發(fā)酵上、中、下游全產(chǎn)業(yè)鏈的關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新體系。

（續(xù)表）

4.3. 高活性工程菌劑規(guī)?；苽浼夹g(shù)體系

采用指數(shù)流加、模糊邏輯控制、反饋控制及提升式菌體懸浮培養(yǎng)等技術(shù)集成，大幅提升工廠發(fā)酵液中的活菌濃度[80-82]；發(fā)明了兩步干燥法生產(chǎn)高活性乳酸菌劑的規(guī)?；苽浼夹g(shù)，開發(fā)出高活性果蔬發(fā)酵專用益生菌劑產(chǎn)品，其活菌數(shù)高達(dá)1 × 1012CFU·g-1[83]。該技術(shù)填補(bǔ)了果蔬發(fā)酵專用菌劑的生產(chǎn)空白。

4.4. 益生菌發(fā)酵果蔬生產(chǎn)新工藝

構(gòu)建直投式益生菌發(fā)酵果蔬新技術(shù)，開發(fā)益生菌發(fā)酵果蔬原漿、發(fā)酵果蔬飲料、發(fā)酵泡菜、發(fā)酵果蔬粉、發(fā)酵果凍等益生菌發(fā)酵果蔬全新產(chǎn)品系列。這些產(chǎn)品不僅具有良好的口感和風(fēng)味[84]，且含有大量對人體健康有益的短鏈脂肪酸、黏性多糖和多肽等活性物質(zhì)[85]。

4.5. 益生菌及其發(fā)酵果蔬產(chǎn)品的功能評價體系

構(gòu)建有關(guān)便秘、免疫抑制、高脂血癥、脂肪肝、結(jié)腸炎和糖尿病等疾病的動物模型，用于評價果蔬發(fā)酵專用益生菌株及其發(fā)酵果蔬產(chǎn)品的功能特性。以植物乳桿菌NCU116為例，對該菌株及其發(fā)酵胡蘿卜產(chǎn)品的益生功能評價結(jié)果表明：植物乳桿菌NCU116及其發(fā)酵胡蘿卜產(chǎn)品在提高小鼠免疫能力、改善腸道黏膜損傷、緩解便秘、緩解糖尿病和結(jié)腸炎、緩解高脂血癥、調(diào)節(jié)腸道菌群等方面具有很好的益生特性[85-96]。

5. 益生菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)業(yè)未來發(fā)展趨勢及挑戰(zhàn)

盡管果蔬益生菌發(fā)酵技術(shù)目前取得了階段性突破，但該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展依然面臨一系列關(guān)鍵科學(xué)技術(shù)問題。首先，由于我們前期的菌種篩選工作主要集中在大宗果蔬發(fā)酵專用優(yōu)良菌株的選育方面，使得目前開發(fā)的益生菌發(fā)酵果蔬系列產(chǎn)品僅涉及胡蘿卜、芒果、雪梨、南瓜以及其他常見的大宗水果和蔬菜。然而，果蔬種類眾多，每種水果和蔬菜都有其獨(dú)特的性質(zhì)，因此，要開發(fā)更多種類的益生菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品，就必然要針對不同果蔬原料篩選具有優(yōu)良發(fā)酵性能的不同種類益生菌株。尤其是對于某些特殊的果蔬原料，篩選適合其發(fā)酵的優(yōu)良菌株具有很大的挑戰(zhàn)。以山楂為例，由于原料本身酸度很高，一般的菌種很難耐受如此高的酸度，因此要篩選適合其發(fā)酵的專用菌種具有一定的困難。其次，關(guān)于益生菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品的安全性和功能性評價，目前僅開展了體外和動物實(shí)驗(yàn)，尚未進(jìn)行系統(tǒng)的臨床研究。為明確益生菌種及其發(fā)酵果蔬產(chǎn)品的益生功能，就要構(gòu)建更加全面的果蔬發(fā)酵益生菌種及其發(fā)酵產(chǎn)品的營養(yǎng)功能和安全性評價體系。此外，還需開展更加先進(jìn)的高活性低成本果蔬發(fā)酵專用益生菌劑的規(guī)?；苽浼夹g(shù)研究。最后，益生元、益生菌和益生菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品對人體健康的影響及其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。有效解決上述關(guān)鍵問題，可為益生菌發(fā)酵果蔬領(lǐng)域的研究及其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展帶來更大的契機(jī)。

6. 結(jié)論

近年來傳統(tǒng)飲料業(yè)的業(yè)績下滑已呈現(xiàn)出不可逆轉(zhuǎn)的趨勢，益生菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品迎合了消費(fèi)者對“安全、營養(yǎng)、美味、健康”產(chǎn)品的需求，符合大健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢。因此，以益生菌發(fā)酵果蔬為代表的健康產(chǎn)品必將為果蔬與發(fā)酵食品行業(yè)帶來重要影響。本文提出了“腸道菌群失調(diào)和膳食纖維攝入不足是慢性疾病發(fā)生的兩大重要誘因”這一觀點(diǎn)，然后對果蔬發(fā)酵專用益生菌種的篩選、高活性工程菌劑的規(guī)?；苽湟约耙嫔l(fā)酵果蔬系列新產(chǎn)品的開發(fā)等果蔬益生菌發(fā)酵關(guān)鍵技術(shù)的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。同時，還從多個角度對果蔬益生菌發(fā)酵技術(shù)發(fā)展趨勢及面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了探討。未來，我們將開發(fā)出越來越多具有“安全、營養(yǎng)、美味、健康”等鮮明特征的益生菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品，以期為消費(fèi)者提供更多優(yōu)質(zhì)的果蔬制品。

致謝

本研究獲得了“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（2017YFD0400705-2、2017YFD0400503-3）、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31560449、31760457）和江西省重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目（20165ABC28004）的支持。

Compliance with ethics guidelines

Qianqian Guan, Tao Xiong and Mingyong Xie declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.